Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino
Summary
Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.
Abstract
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio è stato ampiamente utilizzata per l’acquisizione rapida immagine con un’alta risoluzione assiale da micrometro scala del millimetro. Tecniche tradizionali di luce-foglio implicano l’uso di un fascio di illuminazione singola direzionato ortogonalmente al tessuto dell’esempio. Immagini di grandi campioni che sono prodotte utilizzando un fascio di illuminazione singola contengono strisce o artefatti e soffrono di una risoluzione ridotta dovuto la dispersione e l’assorbimento della luce da parte del tessuto. Questo studio utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione e una semplificata chiarezza ottica, tecniche di taglio per il cuore murino. Queste tecniche permettono di imaging più profondo rimuovendo i lipidi dal cuore e producono un grande campo di formazione immagine, maggiore di 10 x 10 x 10 mm3. Di conseguenza, questa strategia permette di quantificare le dimensioni ventricolari, traccia la linea cardiaca e localizzare la distribuzione spaziale delle proteine cardiache specifiche e canali ionici da post-natali ai cuori di topo adulto con sufficiente contrasto e ad alta risoluzione.
Introduction
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio era una tecnica sviluppata nel 1903 ed è usata oggi come un metodo per studiare l’espressione genica ed anche a produrre modelli 3D o 4D di tessuto campioni1,2,3. Questo metodo di imaging utilizza un sottile foglio di luce per illuminare un unico piano di un campione in modo che solo quell’aereo è catturato dal rivelatore. Il campione può quindi essere spostato in direzione assiale per catturare ogni strato, una sezione alla volta e il rendering di un modello 3D dopo il post-processing delle immagini acquisite4. Tuttavia, dovuto l’assorbimento e la dispersione dei fotoni, LSFM è stato limitato ai campioni che sono entrambi a pochi micron di spessore o sono otticamente trasparente1.
Le limitazioni di LSFM hanno portato a studi approfonditi di organismi che hanno i tessuti che sono otticamente trasparenti, come il pesce zebra. Studi condotti su differenziazione e sviluppo cardiaco sono spesso condotte su zebrafish poiché ci sono geni conservati tra esseri umani e zebrafish5,6. Anche se questi studi hanno portato a progressi nella ricerca cardiaca legate a cardiomiopatie6,7, c’è ancora la necessità di condurre una simile ricerca sugli organismi di livello superiore come i mammiferi.
Mammiferi del tessuto cardiaco presenta una sfida a causa dello spessore e l’opacità del tessuto, l’assorbimento a causa dell’emoglobina nei globuli rossi e lo striping che si verifica a causa di illuminazione unilaterale del campione sotto tradizionale LSFM metodi1 , 8. per compensare queste limitazioni, abbiamo proposto di utilizzare-retro illuminazione e una versione semplificata della chiarezza tecnica9 combinati con un indice di rifrazione corrispondente soluzione (cerchi). Di conseguenza, questo sistema permette l’imaging di un campione che è maggiore di 10 x 10 x 10 mm3 mentre mantenendo una buona qualità risoluzione assiale e laterale piani8.
Questo sistema è stato calibrato prima utilizzando perline fluorescenti disposti in diverse configurazioni all’interno della tubazione di vetro. Quindi, il sistema è stato usato all’immagine cuori murini postnatali e adulti. In primo luogo, il cuore del topo postnatale era imaged in 7 giorni (P7) per rivelare la cavità ventricolare, lo spessore della parete ventricolare, le strutture di valvola e la presenza di trabeculation. In secondo luogo, è stato condotto uno studio per identificare le celle che vuoi differenziare in cardiomiociti utilizzando un cuore del topo postnatale al giorno 1 (P1) con Cre-labeled cardiomiociti e la proteina fluorescente gialla (YFP). Infine, topi adulti a 7,5 mesi erano imaged per osservare la presenza di potassio midollare esterna renale canali (ROMK) dopo la terapia di gene8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema LSFM e la tecnica qui descritta utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica a immagine del cuore del topo nelle fasi post-natali e adulti del suo sviluppo. Un fascio di illuminazione singola tradizionale soffre di photon scattering e assorbimento attraverso tessuti più spessi e più grandi campioni1,3. Le travi-retro forniscono un’illuminazione più uniforme del campione, riducendo al minimo l’effetto di str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA per fornire il campione di topi all’immagine. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (per Tzung K. Hsiai), HL083015 (per Tzung K. Hsiai), HD069305 (per N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (per Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (per Tzung K. Hsiai) e University of Texas System Star finanziamenti (per match Lee).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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