Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen
Summary
Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.
Abstract
Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie hat seit schnelle Bildakquisition mit eine hohe axiale Auflösung von Mikrometer, Millimeter-Skala weit verbreitet. Traditionelle Licht-Blatt Techniken beinhalten die Verwendung von einem einzigen Beleuchtung Strahl orthogonal auf Probe Gewebe gerichtet. Bilder von großen Proben, die mit einem einzigen Beleuchtung Balken hergestellt werden Streifen oder Artefakte enthalten und leiden unter einer reduzierten Auflösung aufgrund der Streuung und Absorption von Licht durch das Gewebe. Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Strahl und eine vereinfachte Klarheit optische clearing-Technik für das murine Herz. Diese Techniken ermöglichen tiefere Bildgebung durch Lipide aus dem Herzen entfernen und produzieren einen großen Bereich der Bildgebung, größer als 10 x 10 x 10 mm3. Als ein Ergebnis dieser Strategie ermöglicht es uns, quantifizieren die ventrikulären Dimensionen, die kardiale Abstammung zu verfolgen und die räumliche Verteilung der Herz-Kreislauf-spezifische Proteine und Ionenkanäle aus der postnatalen zu Erwachsenen Mäuseherzen mit ausreichendem Kontrast zu lokalisieren und Auflösung.
Introduction
Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war eine Technik, die erstmals im Jahre 1903 entwickelt und dient heute als eine Methode, Genexpression zu studieren und auch 3-d- oder 4-D-Modelle von Gewebe Proben1,2,3zu produzieren. Dieses bildgebende Verfahren verwendet eine dünne Folie aus Licht um zu eine einzige Ebene einer Probe zu beleuchten, so dass nur das Flugzeug vom Detektor erfasst wird. Die Probe kann dann in axialer Richtung auf jeweils erfassen verschoben werden Schicht, einen Abschnitt in einer Zeit, und machen Sie ein 3-d-Modell nach der Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder4. Allerdings hat aufgrund der Absorption und Streuung von Photonen, LSFM Proben beschränkt, die entweder wenige Mikrometer dick sind oder optisch transparenten1.
Die Grenzen der LSFM führten zu umfangreichen Studien von Organismen, die Gewebe, die optisch transparent, wie dem Zebrafisch. Studien mit kardialen Entwicklung und Differenzierung werden häufig auf Zebrafisch durchgeführt, da gibt es konservierte Gene zwischen Mensch und Zebrafisch5,6. Obwohl diese Studien zu Fortschritten in der kardiologischen Forschung in Bezug auf Kardiomyopathien6,7geführt haben, muss es noch eine ähnliche forschen auf höherer Ebene Organismen wie Säugetiere.
Säugetier-Herzgewebe Herausforderung eine durch die Dicke und die Deckkraft des Gewebes, die Absorption durch Hämoglobin in den roten Blutkörperchen und das Striping, das durch einseitige Beleuchtung der Probe unter traditionellen LSFM Methoden1 auftritt , 8. um diese Einschränkungen zu kompensieren, haben wir vorgeschlagen, beidseitige Beleuchtung und eine vereinfachte Version der Klarheit Technik9 kombiniert mit einem Brechungsindex passende Lösung (Felgen) zu verwenden. Daher ermöglicht dieses System für die Darstellung einer Probe, die größer als 10 x 10 x 10 mm3 während Aufrechterhaltung eine gute Auflösung in den axialen und lateralen8Flugzeuge.
Dieses System wurde zunächst kalibriert mit fluoreszierenden Perlen in verschiedenen Konfigurationen innerhalb der Glasröhren angeordnet. Dann wurde das System verwendet, um nach der Geburt und Erwachsenen murinen Herzen Bild. Erstens war das postnatale Maus Herz 7 Tage (P7), offenbaren die ventrikuläre Hohlraum, die Dicke der Ventrikelwand, die Ventil-Strukturen und das Vorhandensein von Trabeculation abgebildet. Zweitens wurde eine Studie durchgeführt, um Zellen zu identifizieren, die in Kardiomyozyten differenzieren würde mithilfe einer postnatalen Maus Herz am 1 Tag (P1) mit Cre-Label Kardiomyozyten und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP). Zu guter Letzt wurden Erwachsener Mäuse mit 7,5 Monaten abgebildet, um das Vorhandensein von renal äußeren medulläre Kalium (ROMK) Kanäle nach Gen Therapie8beobachten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das LSFM System und die hier beschriebene Technik nutzt einen beidseitige Beleuchtung Strahl kombiniert mit einer optischen Ausgleich Bild Maus Herzen postnatale und Erwachsenen Stadium seiner Entwicklung. Ein traditionelle einheitliche Beleuchtung Strahl leidet Photon Streuung und Absorption durch dicker und größer Gewebe Proben1,3. Die beidseitige Träger bieten eine gleichmäßigere Ausleuchtung der Probe, so dass die Wirkung von Striping und andere Artefakt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Thao Nguyen und Atsushi Nakano von der UCLA danken für die Bereitstellung der Mäuse Probe Bild. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse NIH HL118650 (um Tzung K. Hsiai), HL083015 (zu Tzung K. Hsiai), HD069305 (zu N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (zum Tzung K. Hsiai und N. C. Chi), HL129727 (zu Tzung K. Hsiai) und University of Texas System STARS Mittel (für Juhyun Lee).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, . Standard Operating Procedures (SOP’s) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, . Amira User’s Guide. , 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
