Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart
Summary
Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.
Abstract
Licht vel fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt voor snelle Beeldacquisitie met een hoge axiale resolutie van micrometer op millimeter schaal. Traditionele licht vel technieken omvatten het gebruik van een interne verlichting lichtbundel orthogonaal gericht monster weefsel. Beelden van grote monsters die worden geproduceerd met behulp van een interne verlichting straal bevatten strepen of artefacten en lijden aan een lagere resolutie als gevolg van de verstrooiing en absorptie van licht door het weefsel. Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting lichtbundel en een vereenvoudigde duidelijkheid optische techniek voor het lymfkliertest hart wissen. Deze technieken zorgen voor diepere beeldvorming door het verwijderen van lipiden uit het hart en produceren van een groot gebied van imaging, groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3. Dientengevolge, deze strategie ons in staat stelt te kwantificeren van de ventriculaire afmetingen, bijhouden van de cardiale bloedlijn en lokaliseren van de ruimtelijke spreiding van de cardiale-specifieke proteïnen en ionenkanalen van de postnatale aan volwassen muis hart met voldoende contrast en resolutie.
Introduction
Licht vel fluorescentie microscopie was een techniek die in 1903 voor het eerst ontwikkeld en vandaag wordt gebruikt als een methode om te studeren van genexpressie en ook om 3D- of 4-D modellen van weefsel monsters1,2,3te produceren. Een dun blad van licht deze beeldvorming methode gebruikt voor het verlichten van een enkel vliegtuig van een sample zodat alleen dat vliegtuig is vastgelegd door de detector. Het monster kan vervolgens worden verplaatst in de axiale-richting te vangen elk layer, een sectie op een moment, en het renderen van een 3D-model na de nabewerking van de beelden van de verworven4. Echter als gevolg van de absorptie en verstrooiing van fotonen, heeft LSFM is beperkt tot monsters die ofwel een paar microns dik of optisch transparant1.
De beperkingen van LSFM hebben geleid tot uitgebreide studies van organismen die weefsels die optisch transparant zijn, zoals de zebravis hebben. Studies waarbij cardiale ontwikkeling en differentiatie worden vaak uitgevoerd op zebrafish aangezien er geconserveerde genen tussen mens en zebrafish5,6. Hoewel deze studies hebben geleid tot vooruitgang in de cardiale onderzoek met betrekking tot hartziekten6,7, moet er nog een soortgelijk onderzoek op een hoger niveau organismen zoals zoogdieren.
Zoogdieren cardiale weefsel uitdaging een vanwege de dikte en de opaciteit van het weefsel, de absorptie te wijten aan hemoglobine in rode bloedcellen en de striping die optreedt als gevolg van ‘ single-sided verlichting van het monster onder traditionele LSFM methoden1 , 8. om te compenseren voor deze beperkingen, hebben wij voorgesteld om tweezijdig verlichting en een vereenvoudigde versie van de duidelijkheid techniek9 gecombineerd met een brekingsindex bijpassende oplossing (velgen) te gebruiken. Dus, dit systeem zorgt voor de beeldvorming van een steekproef die groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3 terwijl het handhaven van een goede kwaliteit-resolutie op de axiale en laterale vliegtuigen8.
Dit systeem werd eerst gekalibreerd met behulp van fluorescerende kralen gerangschikt in verschillende configuraties binnen de glazen buis. Het systeem werd vervolgens gebruikt om het imago van postnatale en volwassen lymfkliertest harten. Ten eerste was het postnatale muis hart beeld op 7 dagen (P7) te onthullen de ventriculaire Holte, de dikte van de ventriculaire muur, de structuren van de klep en de aanwezigheid van trabeculation. Ten tweede, een studie werd uitgevoerd om cellen die in cardiomyocytes onderscheiden zou met behulp van een postnatale muis hart op 1 dag (P1) met Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes en gele fluorescerende eiwit (YFP). Tot slot werden volwassen muizen op 7,5 maanden beeld om te zien hoe de aanwezigheid van renale buitenste Wallenberg kalium (ROMK) kanalen na gene therapie8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het LSFM systeem en de hier beschreven techniek maakt gebruik van een tweezijdig verlichting lichtbundel, gecombineerd met een optische clearing naar afbeelding het hart van de muis in postnatale en volwassen stadia van haar ontwikkeling. Een traditionele interne verlichting straal lijdt aan foton verstrooiing en absorptie via dikker en groter weefsel monsters1,3. De tweezijdig balken zorgen voor een gelijkmatiger verlichting van het monster, aldus het minimalise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil dankbaarheid uiten aan Thao Nguyen en Atsushi Nakano uit UCLA voor het verstrekken van het monster van de muizen naar afbeelding. Deze studie werd ondersteund door subsidies NIH HL118650 (naar Tzung K. Hsiai), HL083015 (naar Tzung K. Hsiai), HD069305 (te N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (aan Tzung K. Hsiai en N. C. Chi), HL129727 (naar Tzung K. Hsiai) en Universiteit van Texas systeem “STARS” financiering (Juhyun Lee).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, . Standard Operating Procedures (SOP’s) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, . Amira User’s Guide. , 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
