Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법
Summary
이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.
Abstract
빛 시트 형광 현미경 검사 법은 축 고해상도 마이크로미터에서 밀리미터 규모와 빠른 이미지 수집을 위해 널리 사용 되었습니다. 전통적인 빛 시트 기술 샘플 조직에서 기가 감독 단일 조명 광속의 사용을 포함 한다. 단일 조명 광선을 사용 하 여 생성 되는 큰 샘플의 이미지 줄무늬 또는 아티팩트를 포함 하 고는 조직에 의해 빛의 흡수와 산란 감소 해상도에서 고통. 이 연구 양면 조명 광속 및 단순화 된 선명도 광학 기술 murine 마음에 대 한 삭제를 사용 합니다. 이러한 기술은 마음에서 지질을 제거 하 여 깊은 이미징에 대 한 허용 하 고 영상, 10 x 10 x 10 m m3보다 더 큰 분야를 생산. 결과적으로,이 전략을 수 있습니다 계량 실의 크기, 심장 계보를 추적 하 고 심장 특정 단백질 및 충분 한 대비와 성인 쥐 심 혼에는 출생에서 이온 채널의 공간 분포를 지역화 하 고 해상도입니다.
Introduction
빛-시트 형광 현미경 검사 법 1903 년에 처음 개발 하는 기술 이었고, 유전자 발현을 연구 하 고 조직 샘플1,2,3또는 4 차원 3 차원 모델을 생성 하는 방법으로 오늘 사용 된다. 이 이미징 방법만 그 비행기는 검출기에 의해 캡처 있도록 샘플의 단일 면을 밝히는 빛의 얇은 시트를 사용 합니다. 샘플 다음 이동할 수 있습니다 축 방향으로 각각 캡처 레이어, 한 번에 하나의 섹션 및 인수 이미지4의 후 처리 후 3 차원 모델을 렌더링. 그러나, 흡수 및 산란 광자의 LSFM 되었습니다 샘플 중 몇 미크론 두께 또는 광학 투명1을 제한.
LSFM의 한계는 제 브라 같은 광학 투명 한 조직 있는 생물의 광범위 한 연구를이 끌고있다. 심장 개발 및 차별화는 종종 연구 zebrafish에 있기 때문에 인간과 zebrafish5,6보존된 유전자. 이러한 연구는 cardiomyopathies6,7에 관련 된 심장 연구에 발전을 이끈, 비록 여전히 포유류와 같은 수준의 유기 체에 유사한 연구 수행 필요가 하다.
포유류 심장 조직의 두께와 불투명도 조직, 전통적인 LSFM 방법1 아래 샘플의 단면 조명으로 인해 발생 하는 스트라이핑에 붉은 혈액 세포, 헤모글로빈 때문 흡수의 과제를 안으십시오 , 8. 이러한 제한에 대 한 보상, 우리 양면 조명과 선명도 기법9 일치 하는 솔루션 (RIMS) 굴절 인덱스와 결합의 단순화 된 버전을 사용 하 여 제안. 따라서,이 시스템은8비행기 축과 측면에서 좋은 품질의 해상도 유지 하면서 10 m m3 x 10 x 10 보다 크면 시료의 이미징에 대 한 수 있습니다.
이 시스템은 먼저 유리 튜브 내에서 다른 구성에서 배열 하는 형광 구슬을 사용 하 여 보정 됩니다. 그런 다음, 시스템 출생 및 성인 murine 마음을 이미지를 사용 되었다. 첫째, 출생 후 마우스 마음은 7 일 (P7) 심 실 구멍, 심 실 벽, 밸브 구조 및 trabeculation의 존재의 두께 공개에 몇 군데. 둘째, 연구 cardiomyocytes Cre 표시와 노란 형광 성 단백질 (YFP) 1 일 (P1)에서 출생 마우스 마음을 사용 하 여 cardiomyocytes에 분화 것 셀을 식별 하기 위해 실시 됐다. 마지막으로, 7.5 개월에서 성인 쥐 유전자 치료8후 신장 외부 골 수 칼륨의 존재 (ROMK) 채널을 관찰 하는 몇 군데 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
LSFM 시스템 및 여기에 설명 된 기술 개발의 출생 및 성인 단계에서 이미지 마우스 마음에 광 청소와 함께 양면 조명 광속을 이용 한다. 전통적인 단일 조명 광선은 광자 산란 및 흡수 두꺼운 및 더 큰 조직 샘플1,3에서 겪고 있다. 양면 보 샘플, 스트라이핑 및 종종 한 면 조명에 의해 생산 하는 이미지에 표시 되는 다른 아티팩트 효과 최소화의 더 심지어 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 마우스 샘플 이미지를 제공 하기 위한 UCLA에서 타오 구 엔과 아츠 시 나카노에 게 감사를 표현 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH (Tzung K. Hsiai)에 HL118650, HL083015 (Tzung K. Hsiai)를, (N. C. 치 및 Tzung K. Hsiai)에 HD069305, HL111437 (Tzung K. Hsiai N. C. 치)를, (에 Tzung K. Hsiai), HL129727 및 텍사스 대학교 시스템 교부 받음 (지주에 자금에 의해 지원 되었다 리)입니다.
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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