Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца
Summary
Это исследование использует технику микроскопии (LSFM) свет лист флуоресценции двусторонняя освещения в сочетании с оптическим выравниванием учиться мышиных сердца.
Abstract
Свет лист флуоресцентной микроскопии широко использовался для приобретения быстрого изображения с высоким разрешением осевой от микрометра миллиметровой шкалой. Традиционные методы свет лист связаны с использованием единого освещения пучка ортогонально направлены на образец ткани. Изображения крупных выборок, которые производятся с использованием единого освещения пучка содержат полосы или артефактов и страдают от сокращения резолюции из-за рассеяния и поглощения света в ткани. Это исследование использует двусторонняя освещения пучка и упрощенная ЯСНОСТИ оптических очистка техника для мышиных сердца. Эти методы позволяют глубже изображений путем удаления липиды из сердца и производят большое поле изображений, больше, чем 10 x 10 x 10 мм3. В результате, эта стратегия позволяет нам определить размеры желудочков, отслеживать линии сердца и локализовать пространственное распределение сердца специфических белков и каналы иона от послеродовой для сердца взрослых мыши с достаточным контрастом и резолюции.
Introduction
Микроскопии флуоресцирования свет листа была впервые разработана в 1903 году техника и сегодня используется как метод для изучения экспрессии генов, а также производить 3-D или 4-D моделей тканей образцы1,2,3. Этот метод визуализации использует тонкий лист света для освещения в одной плоскости образца так, что только что самолет захвачен детектора. Образца, затем могут быть перемещены в осевом направлении-захватить каждый слой, один раздел в то время и визуализации трехмерной модели после пост-обработки изображений4. Однако из-за поглощения и рассеяния фотонов, LSFM была ограничена образцов, которые являются либо несколько микрон или оптически прозрачные1.
Ограничения LSFM привели к обширные исследования организмов, которые имеют тканей, которые оптически прозрачным, как у рыбок данио. Исследования с участием сердца развития и дифференциации часто проводятся на данио рерио, поскольку есть сохранены генов между людьми и данио рерио5,6. Хотя эти исследования привели к достижениям в кардиологических исследованиях, связанных с кардиомиопатии6,7, по-прежнему существует необходимость в проведении аналогичного исследования высокого уровня организмов, таких как млекопитающие.
У млекопитающих сердечной ткани представляет собой проблему, из-за толщины и непрозрачность ткани, поглощение за счет гемоглобина в красных кровяных клеток и чередование, которое происходит из-за одностороннего освещения образца под традиционные методы LSFM1 , 8. чтобы компенсировать эти ограничения, мы предложили использовать двусторонняя освещения и упрощенная версия ЯСНОСТИ техника9 , в сочетании с показателем преломления соответствующие решения (колеса). Таким образом эта система позволяет для визуализации образца, это больше, чем 10 x 10 x 10 мм3 при поддержании хорошего качества резолюции в осевом и боковых плоскостей8.
Эта система была впервые калибруется с помощью флуоресцентных бусы, организовал в различных конфигурациях в стеклянных трубок. Затем система использовалась для изображения послеродовой и взрослых мышиных сердца. Во-первых послеродовой мыши сердце было imaged на 7 дней (P7) выявить полости желудочков, толщина стены желудочков, клапан структур и наличие trabeculation. Во-вторых было проведено исследование для определения ячеек, которые будут дифференцироваться в кардиомиоцитов, используя послеродовой мыши сердца на 1 день (P1) с КРР меченых кардиомиоцитов и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Наконец взрослых мышей на 7,5 месяцев были образы наблюдать присутствие почечной наружной медуллярного калия (ROMK) каналы после генной терапии8.
Protocol
Representative Results
Discussion
LSFM система и метод, описанный здесь использует двусторонняя освещения пучка, в сочетании с оптическим выравниванием изображение сердца мыши на послеродовой и взрослых этапах ее развития. Традиционный одноместный освещения пучка страдает от фотон рассеяние и поглощение через ткань то…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность Тхао Нгуен и Atsushi Nakano из Калифорнийского университета для предоставления мышей образца изображения. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (для Tzung K. Hsiai), HL083015 (для Tzung K. Hsiai), HD069305 (для N. C. Чи и Tzung к Hsiai.), HL111437 (для Tzung K. Hsiai и N. C. Чи), HL129727 (для Tzung K. Hsiai) и университета штата Техас системы звезды, финансирование (для Juhyun Ли).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, . Standard Operating Procedures (SOP’s) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, . Amira User’s Guide. , 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
