Summary
For å forbedre serologiske diagnostiske tester for Mycobacterium tuberculosis antigens, utviklet vi superparamagnetiske jernoksid nanoprober for å oppdage ekstralungetuberkulose.
Abstract
En molekylær bildesonde bestående av superparamagnetisk jernoksid (SPIO) nanopartikler og Mycobacterium tuberculosis overflate antistoff (MtbsAb) ble syntetisert for å forbedre bildefølsomhet for ekstralungetuberkulose (ETB). En SPIO nanosonde ble syntetisert og konjugert med MtbsAb. Den rensede SPIO-MtbsAb nanosonden ble karakterisert ved hjelp av TEM og NMR. For å bestemme sondens målrettingsevne ble SPIO-MtbsAb nanoprober inkubert med Mtb for in vitro imaging assays og injisert i Mtb-vaksinerte mus for in vivo undersøkelse med magnetisk resonans (MR). Kontrastforbedringsreduksjonen på magnetisk resonansavbildning (MR) av Mtb- og THP1-celler viste proporsjonal med SPIO-MtbsAb nanoprobekonsentrasjonen. Etter 30 min intravenøs SPIO-MtbsAb nanoprobe injeksjon i Mtb-infiserte mus, signalintensiteten til det granulomatøse stedet ble forbedret med 14 ganger i T2-vektet MR-bilder sammenlignet med det hos mus som fikk PBS injeksjon. MtbsAb nanoprobes kan brukes som en ny modalitet for ETB deteksjon.
Introduction
Globalt representerer ekstralungetuberkulose (ETB) en signifikant andel av tuberkulosetilfeller (TB). Likevel er ETB-diagnose ofte savnet eller forsinket på grunn av sin lumske kliniske presentasjon og dårlig ytelse på diagnostiske tester; falske resultater inkluderer sputum smører negativt for syre-rask bacilli, mangel på granulomatøs vev på histopatologi, eller unnlatelse av å kultur Mycobacterium tuberculosis (Mtb). I forhold til typiske tilfeller forekommer ETB sjeldnere og innebærer liten frigjøring av Mtb bacilli. I tillegg er det vanligvis lokalisert på vanskelig tilgjengelige steder, for eksempel lymfeknuter, pleura og osteoartikulære områder1. Dermed er invasive prosedyrer for å oppnå tilstrekkelige kliniske prøver, noe som gjør bakteriologisk bekreftelse risikabel og vanskelig, avgjørende2,3,4.
Kommersielt tilgjengelige antistoffdeteksjonstester for ETB er upålitelige for klinisk deteksjon på grunn av deres brede følsomhetsområde (0,00-1,00) og spesifisitet (0,59-1,00) for alle ekstralungeområder kombinert5. Enzymkoblede immunospot (ELISPOT) analyser for interferon-γ, kulturfiltrateprotein (CFP), og tidlig sekretorisk antigenmål (ESAT) har blitt brukt til diagnostisering latent og aktiv TB. Resultatene varierer imidlertid mellom ulike sykdomssteder for diagnostisering av ETB6,7,8. I tillegg ga hud PPD (renset proteinderivat) og QuantiFERON-TB ofte falske negative resultater9. QuantiFERON-TB-2G er en fullblods immunreaktivitetsanalyse, som ikke krever en prøve fra det berørte organet, og dette kan være et alternativt diagnostisk verktøy6,10,11. Andre diagnostiske metoder som vanligvis brukes til TB meningitt, som polymerasekjedereaksjon, er fortsatt for ufølsomme til å trygt utelukke klinisk diagnose12,13. Disse konvensjonelle testene viser utilstrekkelig diagnostisk informasjon for å oppdage det ekstralungeinfeksjonsstedet. Dermed er det klinisk nødvendig med nye diagnostiske modaliteter.
Molekylær avbildning tar sikte på å designe nye verktøy som direkte kan screene spesifikke molekylære mål for sykdomsprosesser in vivo14,15. Superparamagnetisk jernoksid (SPIO), et T2-vektet NMR-kontrastmiddel, kan betydelig forbedre spesifisiteten og følsomheten til magnetisk resonans (MR) avbildning (MR)16,17. Denne nye funksjonelle bildemokaliteten kan nøyaktig skissere vevsendringer på molekylært nivå gjennom ligand-reseptorinteraksjoner. I denne studien ble en ny molekylær bildesonde, bestående av SPIO nanopartikler, syntetisert for å konjugere med Mtb overflate antistoff (MtbsAb) for ETB diagnose. SPIO nanoprobes er minimalt invasiv til vev og organer under undersøkelse18,19. Videre kan disse nanosondene demonstrere nøyaktige MR-bilder ved lave konsentrasjoner på grunn av deres paramagnetiske egenskaper. I tillegg ser SPIO nanoprobes frem minst allergiske reaksjoner fordi tilstedeværelsen av jernioner er en del av normal fysiologi. Her ble følsomheten og spesifisiteten til SPIO-MtbsAb nanoprobene rettet mot ETB evaluert i både celle- og dyremodeller. Resultatene viste at nanosondene var anvendelige som ultrasensitive bildebehandlingsmidler for ETB-diagnose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All protokoll om dyreforsøk følger standard driftsprosedyrer for laboratorieavl i samsvar med National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, 2011) og er godkjent av institusjonell dyreomsorg og brukskomité.
1. SPIO nanopartikkelsyntese
- Forbered dextran-belagt jernoksid magnetiske nanopartikler ved kraftig omrøring av en blanding av dextran T-40 (5 ml; 50% w / w) og vandig FeCl3× 6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) og FeCl2× 4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) løsninger ved romtemperatur.
- Tilsett NH4OH (10 ml; 7,5 % v/v) raskt.
- Rør den svarte suspensjonen ytterligere i 1 t; deretter sentrifuge på 17 300 x g i 10 min og deretter fjerne aggregater.
- Skill de endelige SPIO-produktene fra ubundet dextran T-40 ved gelfiltreringskromatografi20.
- Legg reaksjonsblandingen (totalt volum = 5 ml) i en 2,5 cm × 33 cm kolonne og elute med en bufferløsning som inneholder 0,1 M Na acetat og 0,15 M NaCl ved pH 7,0.
- Samle renset dextran-belagt jernoksid magnetiske nanopartikler i tomvolumet og analyse kolonnen eluates for jern og dextran på 330 og 490 nm ved hjelp av saltsyre og fenol / svovelsyre metoder20, henholdsvis.
2. SPIO-MtbsAb-syntese
- Syntetisere SPIO-konjugert EDBE ved hjelp av tidligere rapporterte metoder21,22.
- Synthesize SPIO-EDBE-succinic anhydrid (SA).
- Rør en alkalisk oppløsning (5 M NaOH; 10 ml)) spio-EDBE og SA (1 g; 10 μmol) ved romtemperatur i 24 timer.
- Dialys løsningen med 20 endringer av 2 L destillert vann ved hjelp av molekylær porøs membran rør (12,000-14,000 MW cutoff). 6 timer for hver endring.
- Til slutt, tilsett 100 μL SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml Fe) til 400 μL på 4,5 mg/ml MtbsAb for å syntetisere SPIO-MtbsAb ved hjelp av 1-hydroksybenzotriazol og (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophospfat som katalysatorer og rør oppløsningen ved rommet i 24.
- Til slutt skiller du løsningene fra det ubundne antistoffet gjennom gelfiltreringskromatografi.
- Legg reaksjonsblandingen (5 ml) på 2,5 cm × 33 cm kolonne og elut ved hjelp av en PBS-buffer. Bekreft Ab-nanopartikkelkompleks (dvs. nanoprobe) ved hjelp av et bicinchoninsyreproteinanalysesett23.
3. Partikkelmorfologi observasjon og avslapning nivå måling
- Undersøk gjennomsnittlig partikkelstørrelse, morfologi og størrelsesfordeling ved hjelp av overføringselektronmikroskop med en spenning på 100 kV.
- Kast komposittdispersjonen på et kobbergitter med 200 mesh og lufttørk ved romtemperatur før den legges den på mikroskopet.
- Mål avslapningstidsverdiene (T1 og T2) av nanosondene ved hjelp av NMR-relaxometeret ved 20 MHz og 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Kalibrer relaxometeret før hver måling.
- Registrer r1 og r2 verdier fra de åtte datapunktene generert gjennom inversjon-utvinning og Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulssekvens, henholdsvis for å bestemme r1 og r2 relaxivities20.
4. Cellebildebehandling
- Dyrke humane monocytter THP-1 i RPMI 1640 med 10% føtal storfe serum, 50 μg/ml gentamycin sulfat, 100 enheter/ml penicillin G natrium, 100 μg streptomycinsulfat og 0,25 μg/ml soppson i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C.
- Inkubator En-MtbsAb nanoprobes (2 mM) med 106 kolonidannende enheter (CFU) av Mycobacterium bovis BCG preinkubert med 1 × 107 aktiverte monocytter i mikrocentrifugerør (1 ml) i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C i 1 t.
- Sentrifugerør ved 200 x g og kast supernatanten. Redissolve pellets i mediet (200 μL).
- Skann prøvene ved hjelp av en rask gradient ekkopulssekvens (repetisjonstid (TR) = 500; Ekkotid(TE) = 20; Flip vinkel = 10°) gjennom 3,0-T MR For å bestemme nanoprobe spesifisitet og følsomhet21,22.
5. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) inokulasjon
- Rekonstituer den lyofiliserte vaksinen eller bakteriebestanden i Sautons medium og fortynn deretter bestanden med saltvann til den er riktig spredt som tidligere beskrevet24.
- Inokulere en levende svekket stamme av M. bovis BCG, hentet fra ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (Connaught stamme; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) med et volum på 0,1 ml/mus (dvs. 107 CFU) intraderhelt inn i venstre eller høyre dorsal scapular hud av mus, som beskrevet tidligere23. Injiser saltvann i mus som negativ kontroll. Overvåk dyr daglig etter BCG-inokulasjon.
- Ofre dyr 1 måned etter bakterier inokulasjon ved hjelp av karbondioksid eutanasi. Høst vevet fra intradermal inokulasjonsstedet. Fest vevet i 10% formalin og bygg inn i parafin for serieseksjoner ved 5-10 μm. Flekkvevseksjoner med hematoksysin/eosin og Ziehl-Neelsen flekker for syreraske bakterier24 og med Berlin blå for jern25.
6. In vivo MR
- Injiser ketamin (80 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (12 mg/kg kroppsvekt) subkutant i mus for dyreanestesi.
- Injiser SPIO-TbsAb-prober (2 nmol/200 μL) i haleårer av mus. MR-bildemus før og umiddelbart etter sondeinjeksjon og deretter hver 5 min i 30 min for å skaffe T2-vektet raske spin-ekkobilder (TR = 3000; TE = 90; visningsfeltet = 8).
- Kvantitativt analysere alle MR-bilder ved hjelp av signalintensitet (SI), en måling av definerte områder av interesse i sammenlignbare steder av en Mtb granuloma senter og ryggmuskelen ved siden av et granulomatous område.
- Beregn relative signalforbedringer ved hjelp av SI-målingen før (SIpre; kontroll) og 0-3 timer etter (SIpost) injeksjon av kontrastmidlene ved hjelp av formelen
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
hvor SIpre er SI av lesjonen på den forhåndsforbedrede skanningen og SIpost er SI av lesjonen på den postforbedrede skanningen21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SPIO-MtbsAb nanoprobe syntese og karakterisering
SPIO nanopartikler ble designet for å konjugere med MtbsAb. Dextran stabilisert på overflaten av SPIO nanopartikler ble krysset av epiklorohydrin. SPIO nanopartikler ble senere innlemmet med EDBE for å aktivere primære aminfunksjonelle grupper i dextran-endene. SA ble deretter konjugert for å danne SPIO-EDBE-SA. SPIO-MtbsAb nanoprobes dannet i det siste trinnet gjennom bøyning av MtbsAb med SPIO-EDBE-SA i nærvær av koblingsmidler. TEM-bildet av SPIO-MtbsAb nanoprobes (Figur 1) viser at SPIO-MtbsAb nanoprobene hadde et godt spredt utseende. Den gjennomsnittlige størrelsen på SPIO-MtbsAb nanoprobekjernen var 3,8 ± 0,4 nm (200 partikkelberegning).
I vandig oppløsning var relaxivity verdiene, r1 og r2, av nanosondene 23 ± 3 og 151 ± 8 mM-1s-1, henholdsvis ved 20 MHz og 37,0 °C ± 0,1 °C. R1/r2 forholdet mellom SPIO-MtbsAb nanoprobes var lik resovist; r 1 og r2 av Resovist (henholdsvis 26 og 164 mM-1s-1)var imidlertid noe høyere enn de av SPIO-MtbsAb nanoprober.
In vitro SPIO-MtbsAb nanoprobe karakterisering og bildebehandling
Først oppdaget vi M. bovis BCG, en syrerask bakterier, gjennom Ziehl-Neelsen farging (Figur 2A). Bakteriene ble isolert og deretter kultivert med sonder som inneholder jern, identifiserbar gjennom Berlin blå farging (Figur 2B). Mtb-målrettingsgraden av SPIO-MtbsAb nanoprobe ble bestemt gjennom T2-vektet MR; negativ forbedring var proporsjonal med mengden sonder festet til bakteriecellen. Nedgangen i SI i nærvær av nanosondene forekom på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2C). Ved 2, 1 og 0,5 mM, nanoprobene konjugert med Mtb utstilt SI på 97,67 ± 3,05, 131,67 ± 4,51, og 257,33 ± 5,03, alle høyere SI på 90,75 ± 2,47 for 1 mM nonconjugert nanoprobe. Sammenlignet med PBS (SI = 1073,43 ± 13,62), ble det ikke angitt noen signalreduksjon i TB-gruppen (SI = 957,33 ± 12,53). Dermed, SPIO sonder spesielt målrettet Mtb bacilli; Videre, på de forbedrede MR-bildene, reduserte SI med økning i mengden SPIO nanopartikler.
Tilsvarende ble reduksjonene i SI på forbedrede MR-bilder notert 1 t etter kulingen av THP-1 monocytter med nanoprobene. En signifikant reduksjon i SI i TB-gruppen ble notert da 1 mM (SI = 225,33 ± 8,58) og 2 mM (SI = 104 ± 2,16) konsentrasjoner av nanosondene ble ansatt sammenlignet med gruppene administrert med PBS bare (SI = 1005,33 ± 16,74) eller ikke administrert med nanopr (SI = 991 ± 8,98). MR SI reduksjon i Mtb grupper for 1 og 2 mM nanoprobes var sammenlignbar med det i den positive 1 mM nanoprobe alene gruppe (SI = 112,33 ± 3,68). Ifølge de ovennevnte resultatene kan SPIO-MtbsAb nanoprobene hjelpe til med å overvåke nanoprobeaktivert THP-1 monocytthandel.
In vivo SPIO-MtbsAb nanoprobe bildebehandling
Etter celleavbildning bestemte vi effekten av in vivo MR for ETB. SPIO-MtbsAb nanoprober ble intravenøst injisert til Mtb-infiserte mus. Et tydelig påviselig MR-signal ble notert i Mtb granulomatous området 0,5 timer etter injeksjon; Imidlertid ble den høyeste SI til bakgrunn observert etter 1 t injeksjon. En signifikant reduksjon i MR-signalering ble notert i Mtb granulomatous området(Figur 3). SI ble målt før (SIpre) og etter (SIpost) kontrastmiddelinjeksjon. En time etter sondeinjeksjon var T2-vektet forbedring av signalreduksjon ved Mtb granulamatøse områder (figur 3B) omtrent 14 ganger høyere enn på kontrollstedene (figur 3A; -1,68% ± 1,32% og -23,43% ± 7,24%; p < 0.001).
Histologisk og immunohistokjemisk evaluering av SPIO-MtbsAb nanoprober
Et subkutant granulom ble utviklet 1 måned etter infeksjon hos C57BL/6 mus. Ny blodvaskalisering ble notert i disse lesjonene sammen med lymfocytter og epitelid-makrofagaggregater. Den organiserte granulomhadde vokst gradvis (Figur 4A). Korrelasjonen av TB-lesjoner med SPIO-MtbsAb MR-signaler ble ytterligere bestemt gjennom immunohistokjemisk reaksjon av Mtb overflate antigen med anti-MtbsAb. Positive MtbsAb uttrykk ble avslørt i granulomatous områder (Figur 4B), med syre-rask bacilli farging positiv på lesjonstedet (Figur 4C). Berlin blå, en ferric jern-positiv flekk, ble brukt til å bestemme følsomheten til sondene til Mtb. Berlin blå-positiv SPIO sonde ble funnet på samme sted som MtbsAb (Figur 4D). Alle samlokaliserte par ble vist i figur 4A-D.
Figur 1: Gjennomsnittlig kjernestørrelse på SPIO-MtbsAb nanoprober i TEM. Den gjennomsnittlige størrelsen på SPIO-MtbsAb nanoprobekjernen var 3,8 ± 0,4 nm, målt ved hjelp av TEM-bildeanalyse (200 partikkelberegning). Skala bar = 15 nm. Dette tallet er endret fra vår forrige studie26. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: In vitro karakterisering av SPIO-MtbsAb nanoprobe. Den syreraske bacillien identifiseres gjennom (A) Ziehl-Neelsen farging og (B) bøyningen av nanosondens jernjern til bakterier identifisert gjennom Berlinblå farging. (C) T2-vektet MR som viser negativ forbedring etter at SPIO-MtbsAb nanoprobene er inkubert med Mtb. Eliminering av SI forekommende doseavhengig etter inkorporering av nanoprobene med Mtb: (1) 90,75 ± 2,47 (1,0 m M Probe); (2) 97,67 ± 3,05 (Mtb + 2,0 mM Probe); (3) 131,67 ± 4,51 (Mtb +1,0 mM Probe); (4) 257,33 ± 5,03 (Mtb + 0,5 mM Probe); (5) 957,33 ± 12,53 (Mtb +0 mM Probe); (6) 1073,43 ± 13,62 (PBS). Ingen påvisbare signalreduksjon er angitt i PBS-kontrollgruppen. (D) Doseavhengig negativ ekstrautstyr i THP-1 monocytter 1 t etter inkubasjon med nanosondene. Skalastolper i (C) og (D) er 5 mm. Dette tallet er endret fra vår forrige studie26. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: In vivo SPIO-MtbsAb nanoprober i subkutane ETB-lesjoner av C57BL/6-mus. (A) Kontroll og (B) Mtb granulomatøse områder. En signifikant 14 ganger reduksjon i MR-signalering finnes i Mtb granulomatøse områder sammenlignet med kontrollområdene 1 t etter probeadministrasjon (-1,68% ± 1,32% vs. -23,43% ± 7,24%, p < 0,001). Resultatene gis som betyr ± SD-er. Statistiske sammenligninger brukte to-tailed Students t-tester. p < 0,05 ble ansett å være betydelig. Dette tallet er endret fra vår forrige studie26. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Korrelasjoner av histologi, immunhistokjemi, syrerask og Berlinblå farging. Histologi av Mtb granulomatøse områder hovedsakelig demonstrere lymfocytter og epithelioid makrofager. Neovaskalisering og rikelig aggregering av lymfocytter og epitelide makrofager observert i disse lesjonene. (A) Organiserte granulomer som ser ut til å utvikle seg gradvis. (B) Immunhistokjemisk farging som demonstrerer MtbsAb-uttrykk i de granulomatøse lesjonene, mens (C) syrerask bacilli er spredt innenfor de samme områdene. (D) Berlin blå farging SPIO sonder er funnet i kolokalisert MtbsAb områder. Berlin blå farging for jernjern demonstrerer sondebøyning til Mtb. Skala barer er 100 μm. Dette tallet er endret fra vår forrige studie26. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I likhet med relevante studier viste våre funn om SPIO-MtbsAb nanoprober en betydelig spesifisitet for Mtb27,28. Subkutan Mtb granulom ble funnet 1 måned etter TB injeksjon i musemodellene. De typiske TB granulomatous histologi funnene inkludert lymfocytter infiltrasjon, tilstedeværelse av epitelide makrofager, og neovaskalisering. Syre-rask bacilli ble spredt i TB lesjoner, bekrefter MtbsAb immunohistochemistry funn. Dette indikerte en immunologisk reaksjon mellom Mtb overflate antigen og MtbsAb. Berlin blå fremhevet de samme områdene med MtbsAb, bekrefter sondens spesifisitet for bøyning med syre-rask Mtb.
Spesielt var omfanget av negativ kontrastforbedring på MR for Mtb- og monocytiske THP1-celler proporsjonal med SPIO-MtbsAb nanoprobekonsentrasjonen. Når mus som bærer Mtb granulomer ble administrert SPIO-MtbsAb nanoprobes, en 14-ganger signalreduksjon på det granulomatøse stedet ble notert på T2-vektet MR-bilder sammenlignet med et motsatt sted med PBS injeksjon. Dette indikerer en betydelig akkumulering av kontrastmiddelet. Resultatene viser en mulighet for å oppnå spesifikk målretting av kontrastmiddel, noe som kan redusere dosekravet for klinisk diagnose.
Våre funn indikerer at disse nanosondene samler et påviselig volum i Mtb granulomatøse lesjoner. Disse resultatene kan bekreftes ved å utvikle en SPIO nanoprobe ved hjelp av anti-hMtbsAb. Ettersom SNOs magnetiske jernoksidkjerne har blitt brukt til å indusere T2-forkortelse i MR-kontrastmidler, tyder funnene på en praktisk og ikke-invasiv tilnærming for å oppdage lignende celleatferd for kliniske diagnoseapplikasjoner.
Her gir vi protokollen bestående av 2 deler: avsnitt 4 til 6 er celle- og dyreavbildning. Teknikkene dekker celledyrking, dyreforsøk og optisk bildebehandling. Avsnitt 1 til 3 er sondesynter. Noen kritiske trinn vil bidra til å replikere eksperimentet. Det kritiske trinnet i SPIO nanopartikkelsyntese er å forberede en dextran-belagt jernoksid magnetiske nanopartikler; det er avgjørende å kraftig røre og fullstendig blande dextran T-40, vandig FeCl3-6H2O, og FeCl2-4H2O løsninger ved en romtemperatur. Det kritiske trinnet for § 2, SPIO-MtbsAb-syntese,konjugerer MtbsAb til SPIO-EDBE-SA for å syntetisere SPIO-MtbsAb. For å velge de riktige katalysatorene og rør løsningen tilstrekkelig ved romtemperatur er også kritisk. Og det kritiske trinnet for avsnitt 3, Partikkelmorfologiobservasjon og avslapningsnivåmåling, er å kalibrere relaxometeret før hver måling. For å nøyaktig beregne størrelsen på prober, er en kalibrering av relaxometer også avgjørende.
I denne studien ble M. bovis BCG og kanin anti-Mtb brukt. Crossreaktivitet av storfe og kanin kilder ble ansett mild, selv om dataene viste at MtbsAb-konjugert SPIO avslørte sterke interaksjoner med M. bovis BCG. Vårt funn antydet at SPIO nanoprobes målrette TB spesielt. Inkubasjonen av nanoprobe- og Mtb-bakterier viste en negativ forbedringsmåte doseavhengig, mens reduksjonen i forbedringen observert for SPIO nanoprober på MR var korrelert med eksistensen av SPIO-partikler. Basert på våre data, videre forskning for å utforske mulige antistoff-bøyning tilnærminger for å forbedre spesifisiteten til nanoprobe ville være velkommen.
Tidligere studier viser at SPIO viser minimal cytotoksisitet uten å endre celleaktivitet ved en konsentrasjon som brukes i denne studien29,30. I samsvar med tidligere forskning viste våre resultater minimal effekt av SPIO nanoprobes til THP-1-celler. THP-1 celler ble inkubert med SPIO nanoprobes med bakterier bøyning i 1 time. SI presenterte en betydelig nedgang i Mtb-gruppene med konsentrasjon på 1 mM eller 2 mM nanoprober, sammenlignet med kontrollgruppen uten nanoprobebehandling eller PBS alene. Resultatet støtter sikkerheten til SPIO nanoprobe, og flere studier som bruker andre bakterielle belastninger for å validere følsomheten til nanosonden er velkommen.
En begrensning av vår studie var at vi ikke kvantifisere biofordelingen av SPIO-MtbsAb nanoprobe hos mus. Videre undersøkte vi ikke intravaskulær halveringstid og leveravsetning av nanosonden, noe som kan endre utsettelsestiden til sondene til THP-1-celler som ligger ved Mtb-lesjonene. Videre forskning på biologisk nedbrytning er berettiget. Videre kunne MR ikke skille om SPIO nanoprobes spesifikt kunne binde seg til bakterier eller monocytter eller om disse sondene var endocytosed.
Til slutt har vi utviklet en klar og gjennomførbar protokoll for å forberede og karakterisere biokompatible SPIO-MtbsAb nanoprober. Disse nanoprobene er hydrofile og sprer seg godt under fysiologiske forhold; de er minimalt cytotoksiske ved lave konsentrasjoner. Også disse SPIO-MtbsAb nanoprobene muliggjør målretting og påvisning av Mtb-infeksjon, som demonstrert av våre in vitro- og in vivo-studier. Dermed kan SPIO-MtbsAb nanoprobes brukes som MR-kontrastmidler for ETB-deteksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen proprietær interesse for materialene som er undersøkt i denne studien.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for økonomisk støtte fra Finansdepartementet Taiwan (gir NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) for å utføre dette forskningsarbeidet. Dette manuskriptet ble redigert av Wallace Academic Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
References
- Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
- Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
- Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
- Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
- Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
- Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
- Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
- Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
- Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
- Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
- Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
- Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , Suppl 1-7 (2003).
- Weissleder, R., Mahmood, U.
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
- Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
- Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
- Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
- Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
- Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
- Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
- Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
- Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
- Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
- Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
- Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
- Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
- Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
- von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).
