الببتيد40 موب للاستخدام في الكشف عن أحداث التهاب العَدلات بوساطة
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للكشف عن وجود العَدلات في أقسام علم الأنسجة الثابتة/بيرميبيليزيد وتقييم حالة تفعيل العَدلات المنقي حية. على وجه الخصوص، يربط الببتيد40 موب lactoferrin موجودة في حبيبات العَدلات الخاصة والتعليم العالي. تعرض محتويات الحبيبية من خلال تفعيل العَدلات أو بيرميبيليزيشن يسمح بوضع علامات على العَدلات.
Abstract
هنا، نحن نقدم بروتوكول التي تنطوي على استخدام موب40، ببتيد المركب مع القدرة على ربط lactoferrin الغليكوزيلاتي المخزنة بتركيزات عالية في حبيبات محددة والعالي من العَدلات. يمكن استخدام هذا البروتوكول تفاصيل كيف مترافق موب40 مباشرة إلى فلوروفوري لوصمة عار العَدلات في الأنسجة الثابتة/بيرميبيليزيد، وكذلك كيفية هذا يمكن استخدامها في التصوير خلية يعيش للاعتداء لتفعيل العَدلات وتحبيب دي. أساليب الكشف العَدلات تقتصر على إبلاغها الأجسام المضادة، التي لا تكون دائماً مناسبة لتطبيقات معينة. موب40 عدم اختراق غشاء الخلية وهكذا تستثني من lactoferrin المخزنة في العَدلات غير-تنشيط/غير-بيرميبيليزيد. موب40 له فائدة إضافية تتمثل في الاعتراف lactoferrin من مجموعة مضيف واسعة، يجعلها مفيدة بشكل خاص لمقارنة النتائج في الدراسات التي تشمل نماذج بحوث متعددة، خفض عدد الكواشف مكررة، وتبسيط البروتوكولات من خلال تلطيخ خطوة واحدة.
Introduction
العَدلات هي واحدة من الأسلحة الرئيسية في جهاز المناعة الفطرية ويجندون بشكل روتيني إلى المواقع التهاب في جميع أنحاء الجسم. دراسة العَدلات قد تضعف إلى حد كبير قبل انتهاء مدة قصيرة في المختبر (أقل من 8 ساعات)، وأدوات الكشف محدودة تحت ظروف القاعدية أو بعد التنشيط. نقدم هنا، بروتوكول مجربة لكشف واسعة ومحددة من العَدلات الثدييات في عينات الثابتة/بيرميبيليزيد. كما أننا نقدم بروتوكول مفصل لتلطيخ العَدلات يعيش مع موب40. استخدام بروتوكول المصبوغة العَدلات حية، يمكن تحديد توقيت ومكان لتفعيل العَدلات. هذا البروتوكول مثالي للباحثين الذين يرغبون في دراسة الإفراج عن التنشيط أو الحبيبية العَدلات. خارج مهامهم مضادات الميكروبات، تقدر العَدلات الآن كخلايا immunomodulatory تشارك في طائفة واسعة من الأمراض والاستجابات المناعية (الفطرية والتكيف)1،2. العَدلات موجودة في معظم التهابات الأنسجة، في أرقام عالية في الأنسجة المصابة والأورام الملتهبة3من خلال الرابطة وكرون تفجر4، في مناطق من الالتهاب غير المعدية مثل سينوفيا (التهاب المفاصل المرضى RA)5. العَدلات تحتوي على أربع فئات من قبل تشكيل حبيبات المسمى أزوروفيل (α) والخاصة (β1) والتعليم العالي (β2) حبيبات والحويصلات الافرازية (γ)6. إلى الهجرة إلى موقع تحريضية، تصبح تنشيط العَدلات المعينين والتتابع تفرز محتويات الحبيبية (تتألف من الالتصاق ومركبات مضادات الميكروبات وجزيئات إيمونومودولاتوري)، الذي يشجع زيادة التوظيف ويسهم في الإصابة بالقرار (بل أيضا إلى تلف أنسجة المضيف)7. في حين تعتبر العَدلات جانبا مهما من الحصانة الفطرية، وحتى الآن هناك الكواشف الكشف القليلة المتاحة لدراستها، وأقل حتى التي يمكن استخدامها لتقييم حالة تفعيل العَدلات الحية.
الأساليب الحالية للكشف عن العَدلات تعتمد على الأجسام المضادة المتولدة ضد المستضدات يتعرض سطح الخلية، مثل لي-6 ز2 أو البروتينات المخزنة على وجه التحديد في حبيبات العَدلات تحت ظروف القاعدية (مثلاً، ميلوبيروكسيداسي ، lactoferrin). وتشمل مزايا مونوكلونل بهم ملزمة قوية وحساسية وبراعة التحليل في ظروف مختلفة. ومع ذلك، هناك عدة سلبيات لاستخدام الأجسام المضادة ومكافحة–لي-6 ز خاصة. هذه الجوانب السلبية تشمل الخصوصية، كما موجودة في معظم الخلايا النقوي في نخاع العظم وفي جميع المحببة بما في ذلك الحمضات؛ Ly-6 ز وهكذا، فك رموز العَدلات من الحمضات مع هذه العلامة تتطلب المجمعات أكثر النهج8. آخر المقايضة متكررة مع الأجسام المضادة هو مداها خصوصية المضيف غالباً محدودة، مما يجعل من الصعب الدراسات المقارنة مع واحد أو أكثر من الأنواع الحيوانية. عيب ثالث من أساليب الكشف عن الأجسام المضادة، خاصة عند استخدام الخلايا الحية أو الحية، هو قدرتها على تعطيل وظيفة الخلية أو تؤدي إلى تنشيط الخلية. على سبيل المثال، يتم تطبيق الإدارة لمكافحة–لي-6 ز للفئران عادة إلى نضوب العَدلات وقلة العَدلات عابر9. بالإضافة إلى ذلك اتضح أن حقن الأجسام المضادة قد حفز الدالة انتيتومور العَدلات10. وأخيراً، الكشف عن أضداد العَدلات لا تكشف عن حالة تنشيط الخلية.
ولقد حددنا 40 أمينية ببتيد حمض يسمى موب40، التي يمكن استخدامها في عدد من الاختبارات لتسمية العَدلات تحت ظروف في المختبر أو في الجسم الحي ، فضلا عن الاعتداء حالة تفعيل العَدلات يعيش11. موب40 مشتق من موب7012، مجال من البروتين ملزمة مخاط سطح reuteri ملبنة وصف في الأصل لقدرته على ربط مخاط13،14. موب40 يتفاعل مع lactoferrin الغليكوزيلاتي موجود بتركيزات عالية في حبيبات العَدلات الخاصة والتعليم العالي. موب40 يمكن أن يتعرض لهذه الحبيبات من خلال الخطوات permeabilization القياسية الموجودة في الأنسجة أو خلية تنشيط fluorescence الفرز البروتوكولات (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتلطيخ قوية من العَدلات الثابتة. عندما يتم الاحتفاظ العَدلات يعيش في حالة المعطل، الببتيد40 موب مستبعد من محتويات الحبيبية، وخلايا لا وصمة عار إيجابية مع العلامة. عند التنشيط، موب40 يمكن ربط lactoferrin المكشوفة وتؤدي إلى تلطيخ قوية مع الببتيد. وهكذا، يمكن استخدام موب40 لتحديد حالة تفعيل العَدلات المنقي، يجعلها علامة جذابة لمتابعة عملية المعدية. كما يتيح القدرة على ربط العيش العَدلات مفعّلة موب40 لاستخدامها كأداة للكشف عن مناطق التهاب العَدلات في نماذج حيوانية حية (مثل ماوس التهاب المفاصل نموذجي15). يمكن استخدام البروتوكولات بالتفصيل مخطوطة هذا المسمى كيف فلوريسسينتلي موب40 للكشف عن العَدلات في الأنسجة علم الأنسجة وكيفية الاعتداء تفعيل العَدلات المنقي حية في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يتم وصف فحوصات اثنين التي يستخدم فيها الببتيد40 موب دراسة التهاب العَدلات والتنشيط. ونحن تبين كيف يمكن أن تكشف موب40 العَدلات الموجودين في أقسام التشريح المرضى أو إظهار دولتهم تفعيل العَدلات المنقي حية باستخدام. الخطوات الأساسية لاستخدام موب40 ككاشف المصبوغة هي نفس م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل فوجاين لوريت مؤسسة (LF-2015-15) (B.S.M.) ويمنح ANR جكجك (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
