Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB40 펩 티 드
Summary
여기, 선물이 조직학 고정/permeabilized 섹션에서 호 중구의 존재를 감지 하 고 라이브 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 평가 하는 프로토콜. 특히, MUB40 펩타이드 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 바인딩합니다. Permeabilization 또는 호 중구 활성화 통해과 립 내용의 노출 호 중구의 마킹 할 수 있습니다.
Abstract
여기, 우리 MUB40, 호 중구의 특정 및 3 차과 립에 높은 농도에서 저장 하는 당화 lactoferrin 바인딩 수와 합성된 펩 티 드의 사용을 포함 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이 호 중구 활성화 및 탈과 립에 대 한 분석 결과를 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 방법 뿐만 아니라 고정/permeabilized 조직에 호 중구 얼룩 어떻게 MUB40 는 fluorophore에 직접 활용이 프로토콜 세부 정보를 사용할 수 있습니다. 호 중구 탐지 방법 항상 특정 응용 프로그램에 적합 하지 않은 종의 단일 클론 항 체로 제한 됩니다. MUB40 세포 막 침투 하지 않습니다 하 고 따라서 lactoferrin 비-활성화/비-permeabilized 호 중구에 저장에서 제외 됩니다. MUB40 는 그것을 여러 연구 모델을 포함 하는 연구에서 결과 비교 하는 데 특히 유용 하 게 만드는 광범위 한 호스트 범위에서 lactoferrin 인식의 추가 혜택 중복 시 약의 수를 줄이고 프로토콜을 단순화 통해 단일 단계 얼룩.
Introduction
호 중구는 타고 난 면역 시스템의 주 무기 중 하나 이며 정기적으로 시체 주위 염증의 사이트에 보충. 호 중구의 연구는 그들의 짧은 수명에은 생체 외에서 (8 h 미만) 및 제한 된 검색 도구 기저 조건 또는 활성화 후 크게 손상 되었습니다. 여기, 우리 고정/permeabilized 샘플에 포유류 호 중구의 광범위 하 고 구체적인 검색 잘 테스트 프로토콜을 제시. 우리는 또한 라이브 neutrophils MUB40얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 라이브 호 중구 얼룩 프로토콜을 사용 하는 타이밍 및 호 중구 활성화의 위치 수 수 정확히 지적. 이 프로토콜은 호 중구 활성화 또는 립 출시를 공부 하고자 연구에 이상적입니다. 넘어 그들의 항균 기능, 호 중구 지금 immunomodulatory 셀 다양 한 질병 및 면역 반응 (타고 난 및 적응형)1,2에 참여 감사 합니다. 호 중구는 가장 염증 성 조직, 감염 된 조직, 염증 성 종양3, IBS, Crohn의 플레어4, 그리고 류 마티스 관절염 (synovia 등 비 감염 성 염증의 지역에서 높은 숫자에 RA) 환자5. 호 중구 미리 형성 된과 립 명명 된 azurophil (α), 특정 (β1), 차 (β2)과 립 분 비 소포 (γ)6의 4 개의 클래스를 포함 합니다. 염증 성 사이트에 마이그레이션, 채용된 호 중구 활성화 되 고 순차적으로 분 비과 립 내용 (접착, 항균 성 화합물 및 immunomodulatory 분자 구성), 추가 모집을 추진 하 고 있으며에 기여 감염 확인 (뿐만 아니라 호스트 조직 손상)7. 호 중구는 간주 하는 동안 거기까지 타고 난 면제의 중요 한 측면은 공부, 사용할 수 있는 몇 가지 탐지 시 약 그리고 생활 호 중구의 활성화 상태를 평가 하기 위해 사용할 수 있는 적은.
Ly-6 G2 등 특히 기저 조건 (예: myeloperoxidase 호 중구과 립에 저장 된 단백질 세포 표면 노출 된 항 원에 대해 생성 하는 단일 클론 항 체에 의존 하는 중 성구 검색의 현재 방법 lactoferrin). 단일 클론 항 체의 장점에는 그들의 강한 바인딩, 감도, 및 다양 한 분석 결과 조건 다양성 포함 됩니다. 그러나, 특히 단일 클론 항 체 및 안티-Ly-6 G을 사용 하 여 여러 가지 단점이 있습니다. 이러한 단점은 포함 특이성, Ly-6 G은 골에 호 산 구는;를 포함 하 여 모든 granulocytes 골수성 세포의 대부분에 존재 따라서,이 표시와 함께 호 중구 호 산 구는에서 해독 더 많은 단지8에 접근 해야 합니다. 단일 클론 항 체와 다른 자주 있 네 개 이상의 동물 종 비교 연구를 어렵게 하 그들의 자주 제한 호스트 특이성 범위입니다. 항 체 탐지 방법, 라이브 셀 또는 vivo에서 사용 하는 경우에 특히의 세 번째 단점은 세포의 기능을 방해 하거나 세포 활성화로 이어질 그들의 잠재력 이다. 예를 들어 관리의 안티-Ly-6 G 마우스 호 중구 감소 및 일시적인 호 중구 감소 증9에 일반적으로 적용 됩니다. 그것은 또한 항 체 주입 호 중구 antitumor 기능10을 자극 수 있습니다 입증 되었습니다. 마지막으로, 호 중구의 항 체 탐지는 셀의 활성화 상태를 공개 하지 않습니다.
우리는 40-아미노 산 펩 티 드 라는 MUB40, 생체 외에서 또는 vivo에서 조건 호 중구 라벨 라이브 neutrophils11의 활성화 상태를 시험 하 수 분석 실험에서에서 사용 될 수 있는 확인 했습니다. MUB40 MUB7012, 원래 점액13,14바인딩할 능력에 대 한 설명 유산 균 reuteri 표면 점액-바인딩 단백질 도메인에서에서 파생 됩니다. MUB40 당화 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 높은 농도에서 존재 하는 상호 작용 합니다. MUB40 histopathology 또는 형광 활성화 된 세포 (FACS) 프로토콜 고정된 호 중구의 강력한 얼룩에 대 한 정렬에 표준 permeabilization 단계를 통해이 립에 노출 될 수 있습니다. 라이브 neutrophils 비활성 상태로 유지 됩니다, MUB40 펩 티 드과 립 내용에서 제외 하 고 셀 할 하지는 표시와 함께 긍정적인 얼룩. 활성화, MUB40 노출된 lactoferrin 바인딩할 하 고 펩 티 드와 강력한 얼룩으로 이어질 수 있습니다. 따라서, MUB40 감염 과정을 따라 매력적인 마커 만들기 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 활성화 된 호 중구 살 바인딩할 수 또한 MUB40 라이브 동물 모델 (예를 들어, 마우스 관절염 모델15)에서 호 중구 염증의 영역을 감지 하는 도구로 사용할 수 있습니다. 이 원고 자세히 어떻게 놓여있는지 MUB40 라는 프로토콜 neutrophils 조직학 조직 및 시험의 시험관에라이브 순화 된 호 중구의 활성화 하는 방법에 공개 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 두 분석 MUB40 펩 티 드 호 중구 염증 및 활성화 연구에 사용 되는 설명 합니다. 우리는 어떻게 MUB40 neutrophils histopathology 섹션에 제시 하거나 라이브 정화 중 성구를 사용 하 여 그들의 활성화 상태를 밝힐 수 있습니다 보여줍니다. 착 색 시 약으로 MUB40 을 사용 하는 중요 한 단계는 다른 형광 탐지 방법으로 동일 합니다. 형광 신호 호환성 및 적절 한 세척 단계 배경 얼룩…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.)에 의해 지원 되었다 고 ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.)를 부여 합니다.
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
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