MUB40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için
Summary
Burada, sabit/permeabilized Histoloji bölümlerde nötrofil var olup olmadığını belirlemek ve canlı arıtılmış nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Özellikle, MUB40 peptid laktoferrin nötrofil özgü ve Tersiyer granül mevcut bağlar. Pozlama permeabilization veya nötrofil harekete geçirmek granül İçindekiler nötrofil işaretleme için sağlar.
Abstract
Burada, biz MUB40, yüksek konsantrasyonlarda nötrofil özel ve Tersiyer granül depolanan glikozile laktoferrin bağlama yeteneği ile sentezlenmiş bir peptid kullanımını içeren bir protokol sağlar. Nasıl Birleşik MUB40 doğrudan bir fluorophore için bu protokolü ayrıntıları bu canlı hücre Imaging’de nötrofil etkinleştirme ve de-granülasyon için tahlil için kullanılabilir ne kadar sabit/permeabilized dokularda de nötrofiller leke için kullanılabilir. Nötrofil algılama yöntemleri her zaman bazı uygulamalar için uygun değildir species-specific monoklonal antikorlar sınırlı olmalıdır. MUB40 hücre zarı nüfuz etmez ve böylece sigara-aktif/sigara-permeabilized nötrofil içinde depolanan laktoferrin üzerinden söz konusu değildir. MUB40 tane laktoferrin geniş ana bilgisayar aralığından, özellikle birden fazla araştırma modeli, ilgili çalışmalarda sonuçları karşılaştırmak için faydalı hale tanıma yararı yinelenen reaktifler sayısını azaltarak ve protokolleri kolaylaştırarak tek adım boyama yoluyla.
Introduction
Nötrofil bir doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil silah ve rutin olarak inflamasyon vücut etrafında siteler için işe. Nötrofil çalışma büyük ölçüde bozulmuş onların kısa ömrü vitro (az 8 h) ve sınırlı algılama araçları bazal koşullar altında veya aktivasyon sonra olmuştur. Burada, sabit/permeabilized örneklerinde memeli nötrofil geniş ve belirli algılanması için iyi sınanmış bir protokol mevcut. Ayrıca canlı nötrofil MUB40ile boyama için detaylı bir protokol sağlar. Canlı nötrofil boyama iletişim kuralını kullanarak, zamanlama ve nötrofil harekete geçirmek konumunu kesin olarak belirlemiş. Bu iletişim kuralı nötrofil harekete geçirmek ya da granül yayın eğitim almak isteyen araştırmacılar için idealdir. Antimikrobiyal işlevlerini, nötrofil şimdi immunomodulatory hücreler çeşitli hastalıklar ve immün yanıt (doğuştan gelen ve edinilmiş)1,2yer olarak takdir edilmektedir. Nötrofil yüksek numaralarından enfekte dokularda, inflamatuar tümörler3, IBS ve Crohn flare-up4sırasında ve romatoid artrit (synovia gibi bulaşıcı olmayan iltihap alanlarında en inflamatuar doku mevcut RA) hastalar5. Nötrofil önceden biçimlendirilmiş granül azurophil (α), özel (β1), Tersiyer (B2) granülleri ve salgı veziküller (γ)6adlı dört sınıfları içerir. Geçiş inflamatuar sitesine üzerine işe nötrofil aktif hale ve sırayla granül içeriği daha fazla istihdamı teşvik ve katkıda bulunur (yapışma, antimikrobiyal bileşikleri ve immunomodulatory molekülleri oluşan), salgılar enfeksiyon çözünürlük (aynı zamanda için ana bilgisayar doku hasarı)7. Nötrofil olarak kabul edilir süre önemli bir özelliği, orada bugüne kadar doğuştan gelen bağışıklık kaç algılama reaktifler onlara eğitim kullanılabilir, ve hatta daha az bu yaşam nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Monoklonal antikor Ly – 6 G2 veya özel olarak nötrofil granül bazal koşullar (Örneğin, myeloperoxidase altında depolanan proteinler gibi hücre yüzeyine maruz antijenlere karşı oluşturulan nötrofil tespit geçerli yöntemleri itimat Laktoferrin). Onların güçlü bağlama, ışık hassasiyeti ve çeşitli tahlil koşullarda çok yönlülük monoklonal antikorlar avantajları şunlardır. Ancak, özellikle kullanarak monoklonal antikorlar ve anti-Ly – 6 G birçok downsides vardır. Ly – 6 G mevcut myeloid hücrelerin bir çoğunluğu kemik iliği ve Eozinofiller de dahil olmak üzere tüm granülosit olduğu gibi bu downsides özgüllüğü, içerir; Böylece, nötrofil eozinofil üzerinden bu marker ile deşifre daha fazla kompleksleri yaklaşımlar8gerektirir. Başka bir sık tradeoff monoklonal antikorlar ile birden fazla hayvan türleri ile karşılaştırma çalışmaları zorlaştırıyor onların kez sınırlı ana özgüllük, aralıktır. Üçüncü ise bir antikor algılama yöntemleri özellikle canlı hücreleri veya içinde vivo kullanırken, hücre işlevi bozabilir veya hücre aktivasyonu için kurşun potansiyellerini dezavantajıdır. Örneğin, yönetim, anti-Ly – 6G farelere yaygın nötrofil tükenmesi ve geçici nötropeni9uygulanır. Ayrıca antikor enjeksiyon nötrofil antitümör işlev10teşvik edebilir kanıtlanmıştır. Son olarak, antikor algılama nötrofil hücre etkinleştirme durumunu ortaya koymuyor.
Biz 40-amino asit peptid MUB40deneyleri bir sayısını nötrofil vitro ve in vivo koşulları altında etiket gibi canlı nötrofil11etkinleştirme durumunu tahlil için kullanılabilir, denilen belirledik. MUB40 MUB7012, aslında onun yetenek mukus13,14bağlamak için açıklanan Lactobacillus reuteri yüzey mukus-bağlayıcı proteinin bir etki elde edilir. MUB40 nötrofil özgü ve Tersiyer granül yüksek konsantrasyonlarda bulunur glikozile Laktoferrin ile etkileşim kurar. MUB40 histopatoloji veya floresan aktif hücre sağlam sabit nötrofil boyama için (FACS) iletişim kuralları sıralama mevcut standart permeabilization adımlarda bu tanecikler için gösterilebilir. Canlı nötrofil Inaktif bir durumda tutulur MUB40 peptid granül içeriğinden söz konusu değildir ve hücreleri marker ile pozitif leke değil. Harekete geçirmek MUB40 maruz laktoferrin bağlamak ve sağlam ile peptid boyama için yol. Böylece, MUB40 arıtılmış nötrofil, yapım o bulaşıcı süreci takip etmek çekici bir işaretleyici etkinleştirme durumunu belirlemek için kullanılabilir. Aktif nötrofil yaşamak için bağlama yeteneği aynı zamanda canlı hayvan modellerinde (Örneğin, bir fare artrit modeli15) nötrofil iltihap alanları tespit etmek için bir araç olarak kullanılacak MUB40 sağlar. Bu el yazması ayrıntılı nasıl fluorescently MUB40 etiketli iletişim kuralları nötrofil Histoloji doku ve nasıl canlı arıtılmış nötrofil vitroaktivasyonu tahlil ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, iki deneyleri MUB40 peptid nötrofil inflamasyon ve harekete geçirmek için kullanılan açıklanır. Biz nasıl MUB40 nötrofil histopatoloji bölümlerde ya da canlı arıtılmış nötrofil kullanarak onların harekete geçirmek durum göstermek-ebilmek açığa vurmak göstermek. MUB40 boyama reaktifi kullanmak için kritik adımlar olarak başka bir floresan algılama yöntemi ile aynıdır. Floresan sinyallerin ve güncelliği ve yeterli çamaşır adımlar arka plan boyama…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Fondation Laurette Fugain (Eğer-2015-15) (B.S.M.) tarafından desteklenen ve ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) verir.
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
