Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la presenza di neutrofili in sezioni di istologia fisso/permeabilizzate e valutare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati dal vivo. In particolare, il peptide di40 MUB associa la lattoferrina presente nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. L’esposizione del contenuto granello tramite permeabilizzazione o l’attivazione del neutrofilo permette per la marcatura dei neutrofili.
Qui, forniamo un protocollo che prevedono l’uso di MUB40, un peptide sintetizzato con la capacità di legare la lattoferrina glicosilata memorizzata ad alte concentrazioni nei granuli specifici e terziari dei neutrofili. Dettagli di questo protocollo come MUB40 coniugato direttamente a un fluoroforo possono essere utilizzato a macchiare i neutrofili in fissa/permeabilizzate tessuti pure come questo possa essere utilizzato in cellule vive di imaging analizzare per-granulazione e attivazione dei neutrofili. Metodi di rilevazione dei neutrofili sono limitati a specie-specifici anticorpi monoclonali, che non sono sempre adatti per determinate applicazioni. MUB40 non penetrare la membrana cellulare e quindi è escluso dalla lattoferrina memorizzata nei neutrofili non-attivato/non-permeabilized. MUB40 ha il beneficio aggiunto di riconoscere lattoferrina da una gamma vasta host, che lo rende particolarmente utile per confrontare i risultati di studi condotti su diversi modelli di ricerca, riducendo il numero di duplicati reagenti e semplificando i protocolli attraverso passo singolo di colorazione.
I neutrofili sono una delle armi primarie del sistema immunitario innato e ordinariamente sono reclutati ai siti di infiammazione intorno al corpo. Lo studio dei neutrofili è stato in gran parte alterato dalla loro durata di vita breve in vitro (meno di 8 h) e dagli strumenti di rilevazione limitata in condizioni basali o dopo l’attivazione. Qui, presentiamo un protocollo ben collaudato per la rilevazione di ampio e specifico dei mammiferi neutrofili nei campioni fissati/permeabilizzate. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la macchiatura diretta neutrofili con MUB40. Utilizzando il protocollo di colorazione del neutrofilo dal vivo, la tempistica e la posizione dell’attivazione dei neutrofili può essere individuati. Questo protocollo è ideale per i ricercatori che desiderano studiare il rilascio dei neutrofili di attivazione o granello. Di là di loro funzioni antimicrobiche, neutrofili sono ora apprezzati come immunomodulatori cellule coinvolte in una vasta gamma di malattie e le risposte immunitarie (innato e adattivo)1,2. I neutrofili sono presenti in tessuti più infiammatori, agli alti numeri nei tessuti infetti, i tumori infiammatori3, durante IBS e di Crohn flare-up4e nelle aree di infiammazione non infettiva quali synovia di artrite reumatoide ( RA) pazienti5. Neutrofili contengono quattro classi di granuli preformati denominato azurophil (α), specifiche (β1), granuli di terziario (β2) e vescicole secretorie (γ)6. Durante la migrazione di un sito infiammatorio, reclutati neutrofili attivati e in sequenza secernono contenuto granello (composto da molecole di immunomodulatori, di adesione e di composti antimicrobici), che promuove ulteriormente reclutamento e contribuisce alla infezione ad alta risoluzione (ma anche a danno di tessuto host)7. Mentre i neutrofili sono considerati un aspetto critico dell’immunità innata, ad oggi vi sono alcuni reagenti di rilevamento disponibili per studiarli, e ancor meno che può essere utilizzato per valutare lo stato di attivazione dei neutrofili vivente.
Attuali metodi di rilevazione dei neutrofili si basano su anticorpi monoclonali generati contro gli antigeni esposti cellula-superficie, ad esempio Ly – 6 G2 o proteine in particolare memorizzati in granuli neutrofili in condizioni basali (ad es., mieloperossidasi lattoferrina). Anticorpi monoclonali vantaggi loro forte legame, sensibilità e versatilità in diverse condizioni di dosaggio. Tuttavia, ci sono diversi aspetti negativi all’utilizzo di anticorpi monoclonali e anti-Ly – 6G in particolare. Questi aspetti negativi includono la specificità, come Ly – 6G è presente sulla maggior parte delle cellule mieloidi nel midollo osseo e su tutti i granulociti compresi gli eosinofilo; decifrare i neutrofili da eosinofilo con questo marcatore richiede pertanto più complessi si avvicina a8. Un altro frequente compromesso con gli anticorpi monoclonali è il loro range di specificità spesso limitata host, rendendo difficili gli studi di confronto con più di una specie animale. Un terzo inconveniente di metodi di rilevazione dell’anticorpo, specialmente quando si utilizzano celle in tensione o in vivo, è il loro potenziale per disturbare la funzione delle cellule o portare alla attivazione delle cellule. Ad esempio, la somministrazione di anti-Ly – 6g ai topi è comunemente applicata allo svuotamento del neutrofilo e neutropenia transitoria9. Inoltre è stato dimostrato che l’iniezione di anticorpi può stimolare funzione antitumorale del neutrofilo10. Infine, rilevazione dell’anticorpo dei neutrofili non rivela lo stato di attivazione della cellula.
Abbiamo identificato un peptide di 40 aminoacidi chiamato MUB40, che può essere utilizzato in un certo numero di saggi per etichettare i neutrofili in condizioni in vitro o in vivo , nonché di analizzare lo stato di attivazione dei neutrofili live11. MUB40 è derivato da MUB7012, un dominio della superficie Lactobacillus reuteri muco-binding protein originariamente descritto per la sua capacità di legare il muco13,14. MUB40 interagisce con lattoferrina glicosilata che è presente in alte concentrazioni nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. MUB40 possono essere esposti a questi granuli attraverso passi di permeabilizzazione standard presenti in istopatologia o fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento protocolli (FACS) per la macchiatura robusta dei neutrofili fissi. Quando i neutrofili dal vivo sono tenuti in uno stato inattivato, il peptide di40 MUB è escluso dal contenuto del granello, e cellule non macchia positive con il marcatore. Al momento dell’attivazione, MUB40 possono associare alla lattoferrina esposta e portare a macchiatura robusta con il peptide. Così, MUB40 può essere utilizzato per determinare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati, che lo rende un marcatore attraente di seguire il processo contagioso. La capacità di legarsi a vivere neutrofili attivati consente inoltre MUB40 essere utilizzato come uno strumento per rilevare le aree di infiammazione del neutrofilo nei modelli animali dal vivo (ad esempio, un mouse artrite modello15). I protocolli in questo dettaglio del manoscritto come fluorescente etichettati MUB40 utilizzabile per rivelare i neutrofili in istologia tessuti e come analizzare l’attivazione dei neutrofili purificati dal vivo in vitro.
Qui, due analisi sono descritti in cui il peptide di40 MUB è usato per studiare l’attivazione e l’infiammazione del neutrofilo. Vi mostriamo come MUB40 può rivelare neutrofili presentano nelle sezioni di istopatologia o mostrano il loro stato di attivazione utilizzando neutrofili purificati dal vivo. I passaggi critici per l’utilizzo di MUB40 come reagente di colorazione sono lo stesso come con qualsiasi altro metodo di rilevazione fluorescente. Cura deve essere presa per assicurare la …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) e ANR JCJC concede (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |