פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות הנוכחות של נויטרופילים בסעיפים היסטולוגיה קבוע/permeabilized ולהעריך את מצב ההפעלה נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. בפרט, פפטיד40 MUB מאגד לקטופרין נוכח בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. חשיפה של התכנים גרגר דרך permeabilization או הפעלה נויטרופילים מאפשר הסימון של נויטרופילים.
Abstract
כאן, אנו מספקים פרוטוקול הכרוכות של MUB40, פפטיד מסונתזת את היכולת לאגד לקטופרין glycosylated המאוחסן בריכוזים גבוהים בגרגרים שלישוני וספציפית של נויטרופילים. זה פרטי פרוטוקול איך MUB40 מצומדת ישירות אל fluorophore יכול לשמש כתם נויטרופילים ברקמות קבוע/permeabilized וכן איך ניתן להשתמש ב- live-תא הדמיה כדי assay הפעלה נויטרופילים, פרור ולהשתחרר. שיטות איתור נויטרופילים מוגבלות תלויי מין נוגדנים חד-שבטיים, אשר אינם תמיד מתאים עבור יישומים מסוימים. MUB40 אינו לחדור את קרום התא, ולכן נכללו לקטופרין המאוחסן בשאינם-מופעל/הלא-permeabilized נויטרופילים. MUB40 יש ערך מוסף של הכרה לקטופרין ממגוון המארחת רחב, שימושי במיוחד עבור השוואת תוצאות מחקרים שכללו מספר מודלים מחקר, צמצום מספר ריאגנטים כפולים, ופישוט פרוטוקולים דרך מכתים צעד אחר צעד.
Introduction
נויטרופילים באחת הזרועות העיקרית של מערכת החיסון המולדת, מגויסים באופן שגרתי לאתרים של דלקת סביב הגוף. המחקר של נויטרופילים נפגע במידה רבה על ידי שלהם אורך קצר במבחנה (פחות מ- 8 שעות) על ידי כלי איתור מוגבלת בתנאים הבזליים או לאחר ההפעלה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נבדק היטב עבור גילוי רחב וספציפי של נויטרופילים בתרבית של דגימות קבוע/permeabilized. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט עבור צביעת נויטרופילים לחיות עם MUB40. באמצעות פרוטוקול מכתימים נויטרופילים בשידור חי, העיתוי והמיקום של הפעלת נויטרופילים יכול ניתן למצוא. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור חוקרים המבקשים ללמוד שחרור הפעלה או גרגר נויטרופילים. מעבר שלהם פונקציות מיקרוביאלית, נויטרופילים יתקבלו בברכה עכשיו כתאים immunomodulatory מעורב במגוון רחב של מחלות תגובות מערכת החיסון (מולדת ולא אדפטיבית)1,2. הנויטרופילים הם נוכח רקמות דלקתיות ביותר, במספרים גבוהים ברקמות נגוע, גידולים דלקתיות3, במהלך IBS, קרוהן התלקחויות4, ו באזורים של דלקת שאינן זיהומיות כגון synovia של דלקת מפרקים שגרונית ( חולי RA)5. נויטרופילים להכיל ארבע כיתות של גרגרי הקבועים מראש בשם azurophil (α), ספציפי (β1), גרגרי השלישון (β2) והפרשה שלפוחית (γ)6. על ההעברה לאתר דלקתיות, נויטרופילים מגויס להיות מופעל, ברצף להפריש גרגר תוכן (מורכבת אדהזיה, תרכובות מיקרוביאלית ומולקולות immunomodulatory), אשר מקדם נוסף גיוס ותורמת זיהום רזולוציה (אלא גם כדי נזק לרקמות מארח)7. בעוד נויטרופילים נחשבים היבט חשוב של מולדת חסינות, לצאת לשם עם ריאגנטים זיהוי כמה זמין ללמוד אותן, אפילו פחות כי ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב ההפעלה של נויטרופילים לחיות.
שיטות הנוכחי של גילוי נויטרופילים להסתמך על נוגדנים חד-שבטיים שנוצר כנגד אנטיגנים חשוף תא-השטח, כגון Ly – 6 G2 או חלבונים ספציפי המאוחסן בגרגרים נויטרופילים בתנאים הבזליים (למשל, myeloperoxidase לקטופרין). היתרונות של נוגדנים חד-שבטיים כוללים שלהם הנחשב חזק, רגישות, רב-תכליתיות בתנאים assay שונים. עם זאת, ישנם מספר חסרונות באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ו- anti-Ly – 6G בפרט. חסרונות אלה כוללים יחודיות, כמו Ly – 6G הוא נוכח במרבית התאים מיאלואידית במח העצם ועל כל גרנולוציטים כולל אאוזינופילים; לפיכך, פיענוח נויטרופילים של אאוזינופילים עם סמן זה דורש יותר מתחמי מתקרב8. עוד חליפין תכופים עם נוגדנים חד-שבטיים הוא בהיקף ירידה לפרטים מארח לעיתים קרובות מוגבל, מקשה על מחקרים השוואה עם מיני בעלי חיים אחד או יותר. החיסרון השלישי של שיטות זיהוי נוגדנים, במיוחד כאשר באמצעות תאים חיים או ויוו, הוא הפוטנציאל שלהם כדי לשבש את תפקוד התא או להוביל ההפעלה התא. לדוגמה, הממשל של אנטי-Ly – 6G לעכברים בדרך כלל חלה על דלדול נויטרופילים, נויטרופניה ארעי9. זה בנוסף הוכח כי הזרקת נוגדנים עשוי לעורר פונקציה antitumor נויטרופילים10. לבסוף, זיהוי נוגדנים של נויטרופילים אינו חושף את מצב ההפעלה של התא.
זיהינו פפטיד חומצה אמינו 40 בשם MUB40, אשר יכול לשמש במספר מבחני תווית נויטרופילים בתנאים במבחנה או ויוו , כמו גם assay את מצב ההפעלה של נויטרופילים בשידור חי11. MUB40 נגזרת70MUB12, תחום של לקטובצילוס reuteri פני השטח מחייב ריר החלבון במקור תיאר את יכולתו לקשור ריר13,14. MUB40 אינטראקציה עם לקטופרין glycosylated הקיים בריכוזים גבוהים בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. יכול להיות חשופים MUB40 גרגירים אלה הצעדים permeabilization סטנדרטי, נוכח histopathology או תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) פרוטוקולים עבור צביעת חזקים של נויטרופילים קבוע. כאשר נויטרופילים לחיות נשמרים במצב מוחלש, פפטיד40 MUB הוא נשלל מן התכנים גרגר, התאים אינו מכתים חיובית עם הסמן. בעת ההפעלה, MUB40 ניתן לאגד לקטופרין חשוף, להוביל מכתים חזקים עם פפטיד. לפיכך, MUB40 יכול לשמש כדי לקבוע את מצב ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים, שהופך אותו סמן אטרקטיבי כדי לעקוב אחר תהליך זיהומיות. היכולת לאגד לחיות נויטרופילים הופעל גם מאפשר MUB40 לשמש ככלי, לזהות אזורים דלקתיים נויטרופילים במודלים חיים של בעלי חיים (למשל, מודל דלקת פרקים15העכבר). הפרוטוקולים בפירוט כתב היד הזה איך fluorescently הנקרא MUB40 יכול לשמש כדי לחשוף נויטרופילים ב היסטולוגיה רקמות וכיצד assay את ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים חיים במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, שני מבחני מתוארים שבו משמש של פפטיד40 MUB ללמוד דלקת נויטרופילים והפעלה. אנו מראים איך MUB40 יכול לחשוף נויטרופילים להציג בסעיפים histopathology או להציג מצב ההפעלה שלהם באמצעות נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. לשלבים הקריטיים עבור שימוש MUB40 ריאגנט מוכתמים הם בדיוק כמו עם כל שיט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Fugain. לורט (אם-2015-15) (B.S.M.) Fondation ומענקים ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
