De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van de aanwezigheid van neutrofielen in secties van de histologie vaste/permeabel en beoordelen van de activeringsstatus van levende gezuiverde neutrofielen. In het bijzonder de MUB40 peptide gebonden Lactoferrine in submodules neutrofiele-specifieke en tertiaire aanwezig. Blootstelling van de submodule inhoud via permeabilization of neutrofiele activering zorgt voor de markering van de neutrofielen.
Abstract
Wij bieden hier een protocol met betrekking tot het gebruik van MUB40, een gesynthetiseerde peptide met de mogelijkheid om het binden van geglycosyleerde lactoferrine opgeslagen in hoge concentraties in specifieke en tertiaire korrels van neutrofiele granulocyten. De gegevens van dit protocol hoe MUB40 geconjugeerd rechtstreeks met een fluorophore kunnen worden gebruikt om vlek neutrofielen in vaste/permeabel weefsels zo goed hoe dit kan worden gebruikt in het leven-cel imaging om assay voor neutrofiele activering en ambtshalve korreling. Neutrofiele detectiemethoden zijn beperkt tot soortspecifieke monoclonal antilichamen, die niet altijd geschikt voor bepaalde toepassingen zijn. MUB40 doet niet doordringen in het celmembraan en is dus uitgesloten van lactoferrine opgeslagen in niet-geactiveerd/niet-permeabel neutrofiele granulocyten. MUB40 heeft het extra voordeel van de erkenning van lactoferrine uit een brede gastheer, waardoor het vooral handig voor het vergelijken van resultaten in studies meerdere onderzoeksmodellen, waarbij het aantal dubbele reagentia te verminderen, en vereenvoudiging van de protocollen via-voor-stapmodus kleuring.
Introduction
Neutrofielen zijn een van de belangrijkste takken van het aangeboren immuunsysteem en routinematig worden gerekruteerd voor de sites van ontsteking rond het lichaam. De studie van neutrofielen heeft geschaad grotendeels door hun korte levensduur in vitro (minder dan 8 h) en beperkte detectieprogramma’s onder basale omstandigheden of na activering. Hier presenteren we een uitgebreid geteste protocol voor de brede en specifieke detectie van zoogdieren neutrofielen in vaste/permeabel monsters. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor live neutrofiele granulocyten met MUB40kleuring. Met behulp van de live neutrofiele kleuring protocol, kunnen het tijdstip en de locatie van neutrofiele activering worden gelokaliseerd. Dit protocol is ideaal voor onderzoekers die willen studeren neutrofiele activering of submodule release. Buiten hun antimicrobiële functies, worden neutrofielen nu gewaardeerd als immunomodulerende cellen betrokken bij een breed scala van ziekten en immuunrespons (aangeboren en adaptief)1,2. Neutrofielen zijn aanwezig in de meest opruiende weefsels, op hoge aantallen in geïnfecteerde weefsels, inflammatoire tumoren3, tijdens IBS en ziekte van Crohn flare-ups4, en op gebied van niet-infectieuze ontstekingen zoals de synovia van reumatoïde artritis ( RA) patiënten5. Neutrofielen bevatten vier klassen van pre-gevormde korrels genaamd azurophil (α), specifieke (β1), tertiaire (β2) korrels en secretoire blaasjes (γ)6. Na de migratie naar een inflammatoire site, aangeworven neutrofielen worden geactiveerd en opeenvolgend afscheiden submodule inhoud (samengesteld uit hechting, antimicrobiële verbindingen en immunomodulerende moleculen), die bevordert verder werving en draagt bij aan infectie resolutie (maar ook voor host weefselschade)7. Terwijl neutrofielen worden beschouwd als een kritiek aspect van aangeboren immuniteit, tot op heden er zijn paar detectie reagentia beschikbaar voor deze bestuderen, en nog minder dat kan worden gebruikt voor het beoordelen van de activeringsstatus van levende neutrofiele granulocyten.
Huidige methoden voor het opsporen van neutrofielen afhankelijk van monoklonale antilichamen tegen celoppervlak blootgestelde antigenen, zoals Ly – 6 G2 of eiwitten specifiek opgeslagen in neutrofiele korrels onder basale omstandigheden (bijvoorbeeld myeloperoxidase gegenereerd Lactoferrine). Voordelen van monoclonal antilichamen zijn hun sterke bindende, gevoeligheid en veelzijdigheid onder verschillende omstandigheden van de test. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan het gebruik van monoklonale antilichamen en anti-Ly – 6G in het bijzonder. Deze nadelen zijn de specificiteit, zoals Ly – 6G is aanwezig op een meerderheid van myeloïde cellen in het beenmerg en op alle granulocyten met inbegrip van de eosinofielen; zo, neutrofielen van eosinofielen ontcijferen met deze markering vereist meer complexen benaderingen8. Een andere frequente afweging met monoklonale antilichamen is hun vaak beperkte host gastheerspecificiteit, waardoor vergelijking studies met meer dan één diersoort omvat moeilijk. Een derde nadeel van antilichaam detectiemethoden, vooral bij het gebruik van levende cellen of in vivo, is hun potentieel voor het verstoren van de functie cel of leiden tot cel activatie. Bijvoorbeeld, is de administratie van anti-Ly – 6G te muizen vaak toegepast op neutrofiele uitputting en voorbijgaande neutropenie9. Bovendien is gebleken dat antilichaam injectie neutrofiele antitumorale functie10kan stimuleren. Tot slot, de opsporing van antilichamen van neutrofielen niet onthullen de activeringsstatus van de cel.
We hebben een 40-amino acid peptide genaamd MUB40, die kan worden gebruikt in een aantal testen om label neutrofielen in vitro of in vivo voorwaarden evenals de activeringsstatus van levende neutrofielen11assay aangemerkt. MUB40 is afgeleid van de MUB7012, een domein van de Lactobacillus reuteri oppervlakte slijm-bindend-proteïne oorspronkelijk beschreven voor haar vermogen om te binden slijm13,14. MUB40 interageert met geglycosyleerde lactoferrine die aanwezig is bij hoge concentraties in neutrofiele-specifieke en tertiaire korrels. MUB40 kunt worden blootgesteld aan deze submodules standaard permeabilization stapsgewijs aanwezig in histopathologie of fluorescentie-activated cell sorting (FACS) protocollen voor robuuste kleuring van vaste neutrofiele granulocyten. Wanneer live neutrofielen in een geïnactiveerd staat worden gehouden, de MUB40 peptide is uitgesloten van de inhoud van de submodule en cellen doen geen positieve vlekken met de markering. Na activatie, kan MUB40 binden aan blootgestelde lactoferrine en leiden tot robuuste kleuring met de peptide. Dus, MUB-40 mag worden gebruikt om de activeringsstatus van gezuiverde neutrofiele granulocyten, waardoor het een aantrekkelijke marker om de besmettelijke proces te volgen. Het vermogen om te binden aan het leven van geactiveerde neutrofiele granulocyten kan ook MUB40 worden gebruikt als een instrument om te controleren op gebieden van neutrofiele ontsteking in levende dierlijke modellen (bijvoorbeeld een muis artritis model15). De protocollen in dit manuscript detail hoe fluorescently label MUB40 kunnen worden gebruikt om te onthullen van de neutrofielen in histologie weefsels en hoe de activering van levende gezuiverde neutrofielen in vitroassay.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zijn twee tests beschreven waarin de MUB40 peptide wordt gebruikt om te studeren neutrofiele ontsteking en activering. Laten we zien hoe MUB40 kan onthullen neutrofielen presenteren in histopathologie secties of hun activeringsstatus met behulp van live gezuiverde neutrofielen weergeven. De kritische stappen voor het gebruik van MUB40 als een kleuring reagens zijn hetzelfde als met elke andere tl detectiemethode. Zorg moet men zich ervan vergewissen van de compatibiliteit van fluores…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) en ANR JCJC verleent (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
