mub40肽在中性炎症事件检测中的应用
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以检测中性粒细胞的存在在固定/渗透组织学切片, 并评估活纯化中性粒细胞的激活状态。特别是, mub40肽结合了存在于中性粒细胞特异性和三级颗粒中的乳铁蛋白。颗粒内容物通过渗透或中性粒细胞活化暴露, 可以标记中性粒细胞。
Abstract
在这里, 我们提供了一个涉及使用 mub40的协议, mub 40 是一种合成肽, 能够将高浓度的糖基化乳铁蛋白结合起来, 储存在中性粒细胞的特定颗粒和三级颗粒中。该协议详细介绍了如何使用 mub40直接与荧光体结合, 以染色固定渗透组织中的中性粒细胞, 以及如何在活细胞成像中使用, 以检测中性粒细胞的活化和去粒化。中性粒细胞检测方法仅限于物种特异性单克隆抗体, 这些抗体并不总是适用于某些应用。mub40不会穿透细胞膜, 因此被排除在储存在非活性无渗透中性粒细胞中的乳铁蛋白中。mub40的额外优点是可以从广泛的宿主范围内识别乳铁蛋白, 这使得它特别适用于比较涉及多个研究模型的研究结果、减少重复试剂的数量和简化协议通过单步染色。
Introduction
中性粒细胞是先天免疫系统的主要武器之一, 经常被招募到身体周围的炎症部位。中性粒细胞的研究在很大程度上受到其体外寿命短 (不到 8小时) 以及在基础条件下或激活后的有限检测工具的影响。在这里, 我们提出了一个经过很好检验的协议, 广泛和具体的检测哺乳动物中性粒细胞在固定渗透样品。我们还提供了一个详细的协议染色活中性粒细胞与 mub40。利用活性中性粒细胞染色协议, 可以确定中性粒细胞活化的时间和位置。该方案是理想的研究人员谁希望研究中性粒细胞激活或颗粒释放。除了抗菌功能, 中性粒细胞现在被视为免疫调节细胞, 参与了广泛的疾病和免疫反应 (先天和适应性)1,2。中性粒细胞存在于大多数炎症组织中, 在感染组织中的数量较多, 在炎症性肿瘤3中, 在 ibs 和克罗恩的爆发过程中, 在 4, 以及在非传染性炎症的地区, 如类风湿关节炎滑膜 (ra) 患者5。中性粒细胞含有四类预先形成的颗粒, 分别称为阿佐罗非 (α)、特异性 (β1)、三级 (β2) 颗粒和分泌囊泡 (γ)6。当迁移到炎症部位时, 被招募的中性粒细胞就会被激活并依次分泌颗粒含量 (由粘附、抗菌化合物和免疫调节分子组成), 从而促进进一步的招募, 并有助于进一步的招募。感染分辨率 (也对宿主组织损伤)7。虽然中性粒细胞被认为是先天免疫的一个关键方面, 但到目前为止, 可用于研究它们的检测试剂很少, 可用于评估活中性粒细胞激活状态的试剂更少。
目前检测中性粒细胞的方法依赖于针对细胞表面暴露的抗原产生的单克隆抗体, 如 ly-6g2或在基础条件下专门储存在中性粒细胞颗粒中的蛋白质 (如髓过氧化物酶), 乳铁蛋白)。单克隆抗体的优点包括在各种检测条件下具有很强的结合性、灵敏度和多功能性。然而, 使用单克隆抗体, 特别是抗 le-6g 有几个缺点。这些缺点包括特异性, 因为 Ly-6G 存在于骨髓中的大多数骨髓细胞和包括嗜酸性粒细胞在内的所有粒细胞上;因此, 用这种标记从嗜酸性粒细胞中破译中性粒细胞需要更多的复合物接近8。单克隆抗体的另一个常见权衡是它们的宿主特异性范围往往有限, 因此很难与不止一种动物进行比较研究。抗体检测方法的第三个缺点, 特别是在使用活细胞或在体内使用时,是它们有可能破坏细胞功能或导致细胞激活。例如, 对小鼠使用抗 le-6g 通常用于中性粒细胞的消耗和短暂性中性粒细胞减少9。此外, 抗体注射还可以刺激中性粒细胞的抗肿瘤功能10。最后, 中性粒细胞的抗体检测并不能揭示细胞的激活状态。
我们已经确定了一种名为 mub 40 的 40-氨基酸肽, 它可用于在体外或体内条件下标记中性粒细胞的一些检测, 并检测活中性粒细胞的激活状态11。mub40来源于mub 7012,这是尿尿乳杆菌表面粘液结合蛋白的一个领域, 最初描述的是它具有结合粘液13,14的能力。mub40与糖基化乳铁蛋白相互作用, 在中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中存在高浓度的糖基化乳铁蛋白。mub40可以通过组织病理学或荧光激活细胞分选 (facs) 协议中的标准渗透步骤暴露在这些颗粒中, 以实现固定中性粒细胞的鲁棒染色。当活中性粒细胞保持在失活状态时, mub40肽被排除在颗粒含量之外, 细胞不会用标记染色呈阳性。激活后, mub40可与暴露的乳铁蛋白结合, 并导致与肽的强染色。因此, mub40可以用来确定纯化中性粒细胞的活化状态, 使其成为跟踪感染过程的一个有吸引力的标记。结合活体激活中性粒细胞的能力还允许 mub40作为工具, 在活体动物模型中检测中性粒细胞炎症区域 (例如,小鼠关节炎模型15)。本手稿中的协议详细说明了如何荧光标记的 mub40可以用来揭示组织中的中性粒细胞, 以及如何检测活体纯化中性粒细胞在体外的激活。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 两个检测中描述了 mub40肽用于研究中性粒细胞炎症和激活。我们展示了 mub40如何揭示组织病理学部分中存在的中性粒细胞, 或使用活纯化的中性粒细胞显示其激活状态。使用 mub40作为染色试剂的关键步骤与任何其他荧光检测方法相同。必须注意确保荧光信号的兼容性, 并采取适当的洗涤步骤来消除背景染色。要获得良好的染色效果, 最重要的考虑因素是显微镜、玻?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 laurette fugain 基金会 (lf-2015-15) (b. s. m.) 和 anr jcjc 赠款 (anr-17-ce15-0012) (b. s. m.) 的支持。
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
