El péptido de40 de MUB para uso en la detección de eventos de la inflamación mediada por neutrófilos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para detectar la presencia de neutrófilos en las secciones fijas/permeabilized histología y evaluar el estado de activación de los neutrófilos purificados vivo. En particular, el péptido de40 MUB ATA lactoferrina presente en gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. Exposición de los contenidos del gránulo a través de permeabilización o neutrófila activación permite el marcado de los neutrófilos.
Abstract
Presentamos un protocolo que implica el uso de MUB40, un péptido sintetizado con la capacidad de enlazar glucosilada lactoferrina almacenado en altas concentraciones en específicos y terciarios los gránulos de los neutrófilos. Este detalles del protocolo MUB40 conjugado directamente a un fluoróforo pueden utilizarse para teñir neutrófilos en tejidos fijados/permeabilized así como cómo esto puede ser usado en imágenes de células vivas al ensayo para la granulación y la activación de neutrófila. Métodos de detección de neutrófilos se limitan a anticuerpos monoclonales específicos para cada especie, que no siempre son convenientes para ciertas aplicaciones. MUB40 no penetra la membrana celular y por lo tanto se excluye de lactoferrina en neutrófilos no-activado/no-permeabilized. MUB40 tiene la ventaja de reconocer lactoferrina de un rango de hospederos amplio, lo que es especialmente útil para comparar resultados en estudios con múltiples modelos de investigación, reduciendo el número de duplicados y simplificando protocolos a través del solo paso de tinción.
Introduction
Neutrófilos son uno de los principales brazos del sistema inmune innato y son reclutados sistemáticamente a los sitios de inflamación alrededor del cuerpo. El estudio de los neutrófilos se ha deteriorado en gran parte por su corta vida útil en vitro (menos de 8 h) y herramientas de detección limitada bajo condiciones basales o luego de la activación. Aquí, presentamos un protocolo bien probado para la detección amplio y específico de los neutrófilos mamíferos en muestras fijas/permeabilized. También proporcionamos un protocolo detallado para la tinción energizados neutrófilos con MUB40. Utilizando el protocolo de tinción neutrófilo vivo, el momento y el lugar de la activación de neutrófila pueden ser identificados. Este protocolo es ideal para investigadores que deseen estudiar la liberación de activación o del gránulo neutrófilo. Más allá de sus funciones antimicrobianas, neutrófilos ahora son apreciados como inmunomoduladores de células implicadas en una amplia gama de enfermedades y la respuesta inmune (innata y adaptativa)1,2. Están presentes en los tejidos más inflamatorios, en un número elevado en los tejidos infectados, en tumores inflamatorios3, IBS y enfermedad de Crohn las llamas4y en áreas de inflamación no infecciosa como el synovia de la artritis reumatoide (neutrófilos Pacientes de RA)5. Neutrófilos contienen cuatro clases de gránulos preformados llamados azurófilos (α), específicos (β1), gránulos terciarios (β2) y vesículas secretoras (γ)6. Migración a un sitio inflamatoria, neutrófilos reclutados se activan y secuencialmente secretan gránulos contenidos (compuestos de adherencia, compuestos antimicrobianos y moléculas inmunomoduladoras), que promueve la contratación y contribuye a resolución (pero también al daño de tejido de host) de infección7. Neutrófilos se consideran un aspecto fundamental de la inmunidad innata, hasta la fecha hay son pocos reactivos de detección disponibles para estudiarlos, y aun menos que puede utilizarse para evaluar el estado de activación de los neutrófilos de vida.
Los métodos actuales de detección de neutrófilos dependen de anticuerpos monoclonales generados contra los antígenos expuestos superficie de la célula, como proteínas específicamente almacenadas en gránulos neutrófilos bajo condiciones basales (por ejemplo, mieloperoxidasa o Ly – 6 G2 lactoferrina). Ventajas de anticuerpos monoclonales incluyen su atascamiento fuerte sensibilidad y versatilidad en diferentes condiciones de ensayo. Sin embargo, hay varias desventajas al uso de anticuerpos monoclonales y anti-Ly – 6G en particular. Estas desventajas incluyen la especificidad, como Ly – 6G está presente en la mayoría de las células mieloides en médula ósea y sobre todo granulocitos incluyendo eosinófilos; por lo tanto, descifrar neutrófilos de eosinófilos con este marcador requiere complejos más se acerca a8. Otro intercambio frecuente con anticuerpos monoclonales es su anfitrión a menudo limitada especificidad, dificultando los estudios de comparación con más de una especie animal. Un tercer inconveniente de los métodos de detección de anticuerpos, especialmente cuando se utilizan células vivas o en vivo, es su potencial para alterar la función de la célula o llevar a la activación de la célula. Por ejemplo, la administración de anti-Ly – 6G a los ratones se aplica comúnmente a agotamiento del neutrófilo y neutropenia transitoria9. Además se ha demostrado que la inyección de anticuerpos puede estimular función antitumoral neutrófilos10. Finalmente, la detección de anticuerpo de neutrófilos no revela el estado de activación de la célula.
Hemos identificado un péptido de 40 aminoácidos llamado MUB40, que puede utilizarse en un número de ensayos para etiqueta de neutrófilos bajo condiciones en vitro o en vivo , así como analizar el estado de activación de neutrófilos en11. MUB40 se deriva de MUB7012, un dominio de la proteína de unión a moco superficial Lactobacillus reuteri , descrito originalmente por su capacidad para enlazar moco13,14. MUB40 interactúa con lactoferrina glucosilada que está presente en altas concentraciones en los gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. MUB40 puede estar expuesto a estos gránulos a través de pasos de permeabilización estándar presentes en la histopatología o celular activado por fluorescencia clasificación protocolos (FACS) para tinción robusto de neutrófilos fijadas. Cuando neutrófilos vivo se mantienen en un estado inactivo, el péptido de40 MUB queda excluido de los contenidos del gránulo, y células no tiñen positivamente con el marcador. Después de la activación, MUB40 puede enlazar a la lactoferrina expuesta y conducir a coloración robusta con el péptido. Por ello, MUB40 puede utilizarse para determinar el estado de activación de los neutrófilos purificados, lo que es un marcador de atractivo a seguir el proceso infeccioso. La capacidad de enlazar a vivir neutrófilos activados también permite MUB40 para ser utilizado como una herramienta para detectar áreas de inflamación neutrófila en modelo animal vivo (por ejemplo, un ratón artritis modelo15). Los protocolos en este detalle del manuscrito como fluorescencia etiquetada MUB40 pueden utilizarse para revelar neutrófilos en histología tejidos y cómo analizar la activación de neutrófilos purificados vivo en vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se describen dos ensayos en que el péptido de40 MUB se utiliza para estudiar la activación e inflamación neutrófila. Mostramos cómo puede revelar MUB40 neutrófilos presentan en las secciones de la histopatología o mostrar su estado de activación utilizando neutrófilos purificados vivo. Los pasos críticos para el uso de MUB40 como un reactivo de tinción son los mismos que con cualquier otro método de detección fluorescente. Debe tenerse cuidado para garantizar la compat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) y convocatoria de ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
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