Пептид40 MUB для использования в обнаружении нейтрофилов опосредованной воспаление события
Summary
Здесь мы представляем протокол обнаружить присутствие нейтрофилов в разделах фиксированной/permeabilized гистология и оценить состояние активации живой очищенный нейтрофилов. В частности MUB пептид40 связывает лактоферрина в гранулы нейтрофилов конкретных и высшего. Экспозиции блок содержимого через permeabilization или нейтрофилов активации позволяет для маркировки нейтрофилов.
Abstract
Здесь мы предоставляем протокол с применением MUB40, синтезированных пептидов с способностью связывать гликозилированного лактоферрин, хранящиеся в высоких концентрациях в конкретных и третичного Гранулы нейтрофилов. Этот протокол детали, как MUB40 конъюгированных непосредственно к Флюорофор может использоваться для пятно нейтрофилов в фиксированной/permeabilized тканей также, как это может использоваться в живой клетки imaging для анализа для активации нейтрофилов и де грануляции. Методы обнаружения нейтрофилов ограничены к поставляемому моноклональные антитела, которые не всегда подходят для определенных приложений. MUB40 не проникают клеточной мембраны и таким образом, исключается из лактоферрин, хранящиеся в не активировано/не permeabilized нейтрофилов. MUB40 имеет добавленное преимущество признания лактоферрина из широкого хозяйского диапазона, что делает его особенно полезны для сравнения результатов исследований с участием нескольких исследований моделей, сократить количество повторяющихся реагентов и упрощения протоколы через единый этапа окрашивания.
Introduction
Нейтрофилы являются одним из основных оружия иммунной системы и регулярно привлекаются к местам воспаления вокруг тела. Изучение нейтрофилов была значительной степени снижена путем их короткий срок в пробирке (менее 8 h) и средства ограничены обнаружения базальных условиях или после активации. Здесь мы представляем испытанный протокол для обнаружения широкого и конкретного млекопитающих нейтрофилов в образцах исправлены/permeabilized. Мы также предоставляем подробный протокол для окрашивания живой нейтрофилов с MUB40. Можно pinpointed по протоколу живой нейтрофилов окрашивание, сроков и местоположения нейтрофилов активации. Этот протокол является идеальным для исследователей, которые желают учиться нейтрофилов активации или гранул выпуска. Помимо их антимикробной функций нейтрофилы теперь ценятся как иммуномодулирующих клеток, участвующих в широкий спектр заболеваний и иммунных реакций (врожденная и адаптивного)1,2. Нейтрофилы присутствуют в наиболее воспалительных тканей, на высоких числах в инфицированных тканях, в воспалительных опухоли3, во время IBS и крона вспышки4и в районах неинфекционного воспаления например synovia (ревматоидный артрит Больных РА)5. Нейтрофилов содержат четыре класса с именем azurophil (α), специфические (β1), третичные (β2) гранул и секреторные пузырьки (γ)6предварительно сформированные гранулы. После миграции воспалительных сайт набранных нейтрофилы активируются и последовательно выделяют содержимое гранул (состоящий из адгезии, антимикробных соединений и иммуномодулирующих молекул), которые способствует дальнейшему вербовки и способствует инфекция резолюции (но и повреждение тканей хост)7. В то время как нейтрофилы считаются важным аспектом врожденного иммунитета, на сегодняшний день являются несколько обнаружения реагентов для их изучения, и даже меньше, который может использоваться для оценки состояния активации нейтрофилов жизни.
Нынешние методы обнаружения нейтрофилов полагаться на моноклональные антитела, созданных против клетк поверхности подвергаются антигенов, например Ly – 6 G2 или белки, специально хранится в нейтрофильных гранул в базальных условиях (например, миелопероксидаза лактоферрин). Преимущества их сильной привязки, чувствительность и гибкость при различных условиях пробирного моноклональных антител. Однако есть несколько недостатков с помощью моноклональных антител и анти Ly – 6G в частности. Эти недостатки включают специфику, как Ly – 6G присутствует на большинстве миелоидных клеток в костном мозге и на всех гранулоцитов, включая эозинофилов; Таким образом расшифровка нейтрофилов из эозинофилов с этот маркер требует более комплексы подходов к8. Другой частой компромисс с моноклональными антителами — их часто ограниченный узел специфика хребет, затрудняет сравнение исследований с более чем одной видов животных. Третий недостаток методы обнаружения антител, особенно при использовании живой клетки или в естественных условиях, является их потенциал нарушить функцию клеток или привести к активации клеток. Например администрация анти Ly – 6G для мышей обычно применяется для нейтрофилов истощения и переходных нейтропении9. Дополнительно было продемонстрировано, что инъекции антител может стимулировать нейтрофилов противоопухолевые функции10. Наконец обнаружение антител нейтрофилов не показывают состояние активации клеток.
Мы определили 40-амино кислоты пептид, под названием MUB40, который может использоваться в ряде анализов ярлык нейтрофилов в условиях in vitro или в естественных условиях , а также анализа состояния активации живой нейтрофилов11. MUB40 является производным от MUB7012, домен Lactobacillus reuteri поверхности слизь связывающий белок, первоначально описанных за его способность связывать слизи13,14. MUB40 взаимодействует с гликозилированного лактоферрин, который присутствует в высоких концентрациях в гранулы нейтрофилов конкретных и высшего. MUB40 могут быть подвержены эти гранулы через стандартный permeabilization шаги в гистопатологии или активирована флуоресценции клеток, сортировка (FACS) протоколы для надежной пятнать фиксированной нейтрофилов. Когда живой нейтрофилов хранятся в состоянии инактивированная, пептид40 MUB исключается из содержимое гранул, и клетки не испачкать положительных с маркером. После активации MUB40 можно привязать к воздействию лактоферрин и привести к надежной окрашивание с пептида. Таким образом MUB40 может использоваться для определения состояния активации очищенный нейтрофилов, что делает его привлекательным маркер следовать инфекционного процесса. Возможность привязать жить активированные нейтрофилы также позволяет MUB40 , чтобы использоваться в качестве инструмента для выявления областей нейтрофилов воспаления в живых животных моделях (например, мыши артрит модель15). Протоколы в этой рукописи детали как дневно помечены MUB40 может использоваться раскрыть нейтрофилов в Гистология ткани и как assay активации живой очищенный нейтрофилов в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь двух анализов описаны, в котором MUB пептид40 используется для изучения нейтрофилов воспаление и активации. Мы покажем, как можно выявить MUB40 нейтрофилов присутствует в гистопатологии секций или показать их состояние активации с использованием живой очищенный нейтрофи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фюгеном Лоретт Fondation (LF-2015-15) (B.S.M.) и ANR JCJC грантов (АНР-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
