Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein der Neutrophilen behoben/permeabilized Histologie Abschnitte erkennen und bewerten den Aktivierungsstatus der live gereinigten Neutrophilen. Vor allem bindet MUB40 Peptid Lactoferrin in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden. Exposition der Granulat-Inhalte durch Permeabilisierung oder Neutrophilen Aktivierung ermöglicht die Kennzeichnung von Neutrophilen.
Abstract
Hier bieten wir ein Protokoll unter Verwendung von MUB40, ein synthetisiertes Peptid mit der Fähigkeit, glykosylierten Lactoferrin gespeichert in hohen Konzentrationen in bestimmten und tertiäre Körnchen der Neutrophilen zu binden. Dieses Protokolldetails wie MUB40 direkt an ein Fluorophor konjugiert einsetzbar, Neutrophile in feste/permeabilized Geweben sowie zu beflecken, wie Hiermit können live Cell Imaging für die Neutrophilen Aktivierung und de-Granulierung assay. Neutrophilenzahl Nachweismethoden beschränken sich auf Spezies-spezifische monoklonale Antikörper, die nicht immer für bestimmte Anwendungen geeignet sind. MUB40 die Zellmembran nicht durchdringen und ist somit von Lactoferrin gespeichert in nicht-aktiviert/nicht-permeabilized Neutrophilen ausgeschlossen. MUB40 hat den zusätzlichen Vorteil erkennen Lactoferrin aus ein breites Wirtsspektrum, macht es besonders nützlich für den Vergleich der Ergebnisse in Studien mit mehreren Forschungsmodelle, Verringerung der Zahl der doppelte Reagenzien und Vereinfachung der Protokolle durch ein-Schritt-Färbung.
Introduction
Neutrophile sind eines der primären Waffen des angeborenen Immunsystems und werden routinemäßig zu den Stätten der Entzündung um den Körper angeworben. Die Studie der Neutrophilen wurde weitgehend beeinträchtigt durch ihre kurze Lebensdauer in Vitro (weniger als 8 h) und begrenzte Erkennungs-Tools unter basalen Bedingungen oder nach der Aktivierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine erprobte Protokoll für die Breite und spezifische Erkennung von Säugetier-Neutrophils in feste/permeabilized Proben. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll zum Beizen live Neutrophilen mit MUB40. Mit dem live Neutrophilenzahl Färbung Protokoll, können den Zeitpunkt und Ort der Neutrophilen Aktivierung geortet werden. Dieses Protokoll ist ideal für Forscher, die Neutrophilen Aktivierung oder Granulat Release studieren möchten. Jenseits ihrer antimikrobiellen Funktionen werden Neutrophile jetzt als immunmodulatorische Zellen in einer Vielzahl von Krankheiten und Immunreaktionen (angeborene und adaptive)1,2geschätzt. Neutrophile sind im meisten entzündlichen Gewebe, bei hohen Stückzahlen im infizierten Gewebe, entzündliche Tumoren3, während IBS und Morbus Crohn Schübe4, und in Bereichen der nicht-infektiöse Entzündung wie die Synovia der rheumatoiden Arthritis ( RA) Patienten5. Neutrophilen enthalten vier Klassen von vorgeformten Körnchen namens Azurophil (α), spezifische (β1), Tertiär (β2) Granulat und sekretorischen Vesikel (γ)6. Bei der Migration zu einer entzündlichen Site rekrutierte Neutrophilen werden aktiviert und sequenziell sezernieren Granulat Inhalte (bestehend aus Adhäsion, antimikrobielle Substanzen und immunmodulatorischen Molekülen), die fördert weitere Rekrutierung und trägt zur Infektion Auflösung (aber auch zu Host Gewebeschäden)7. Während Neutrophile gelten ein kritischer Aspekt der angeborenen Immunität, bisher gibt es sind einige Nachweisreagenzen zur Verfügung, um sie zu studieren, und noch weniger, die kann verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der lebenden Neutrophilen zu beurteilen.
Aktuelle Methoden zur Erkennung von neutrophilen Granulozyten verlassen sich auf monoklonale Antikörper gegen die Zelloberfläche exponierten Antigene, wie Ly – 6 G2 oder Proteine im einzelnen gespeichert in Neutrophilen Granulat unter basalen Bedingungen (z. B. Myeloperoxidase erzeugt Lactoferrin). Vorteile von monoklonalen Antikörpern sind ihre starke Bindung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit unter verschiedenen Assay-Bedingungen. Es gibt jedoch einige Nachteile mit monoklonalen Antikörpern und Anti-Ly – 6G im besonderen. Diese Nachteile sind die Spezifität, Ly – 6G auf der Mehrzahl der myeloischen Zellen im Knochenmark und auf alle einschließlich der eosinophilen Granulozyten vorliegt; Entschlüsselung von Neutrophilen aus eosinophilen mit dieser Marker erfordert daher mehr komplexe Ansätze8. Eine weitere häufige Kompromiss mit monoklonalen Antikörpern ist ihre oft begrenzte Spezifität Wirtsspektrum, Vergleichsstudien mit mehreren Tierarten erschwert. Ein dritter Nachteil der Antikörper Abfragung Methoden, insbesondere bei Verwendung von lebenden Zellen oder in vivo, ist ihr Potenzial Zellfunktionen zu stören oder zu Zellaktivierung führen. Beispielsweise wird die Verwaltung von Anti-Ly – 6 G, Mäuse häufig auf Neutrophilen Erschöpfung und vorübergehende Neutropenie9angewendet. Zudem ist nachgewiesen, dass Antikörper Injektion Neutrophilenzahl Antitumor-Funktion10stimulieren kann. Schließlich verrät Antikörpernachweis der Neutrophilen nicht den Aktivierungsstatus der Zelle.
Wir haben festgestellt, dass eine 40-amino Acid Peptid namens MUB40, die in einer Reihe von Tests zu beschriften Neutrophilen in Vitro oder in Vivo Bedingungen sowie die Aktivierungsstatus des live Neutrophilen11assay verwendet werden können. MUB40 leitet sich vom MUB7012, eine Domäne der Lactobacillus Reuteri Oberfläche Schleim-Bindeprotein ursprünglich für seine Fähigkeit, Schleim13,14binden beschrieben. MUB40 interagiert mit glykosylierten Lactoferrin, das in hohen Konzentrationen in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden ist. MUB40 können diese Module durch standard Permeabilisierung Schritte in Histopathologie oder Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Protokolle für robuste Färbung der festen Neutrophilen ausgesetzt werden. Wenn live Neutrophilen in einem inaktivierten Zustand gehalten werden, das MUB40 Peptid ist aus dem Granulat Inhalt ausgeschlossen, und Zellen keine Flecken, positiv mit dem Marker. Nach der Aktivierung können MUB40 binden an exponierten Lactoferrin und zu robusten Färbungen mit das Peptid führen. So kann MUB40 verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der gereinigten Neutrophilen, so dass es einen attraktive Marker der infektiösen Prozess folgen bestimmen. Auch Möglichkeit, binden an aktivierte Neutrophilen Leben MUB40 als Werkzeug verwendet werden, um Bereiche der Neutrophilen Entzündung in live Tiermodellen (z. B. einer Maus Arthritis Modell15) zu erkennen. Die Protokolle in diesem Manuskript Detail wie Eindringmittel beschriftet MUB40 einsetzbar, Neutrophile in Histologie Gewebe und wie man die Aktivierung des live gereinigten Neutrophilen in-vitro-Tests zu offenbaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier sind zwei Tests beschrieben, in denen das MUB40 Peptid verwendet wird, um Neutrophilenzahl Entzündung und Aktivierung zu studieren. Wir zeigen, wie MUB40 offenbaren kann, Neutrophile in Histopathologie Abschnitte oder zeigen ihren Aktivierungsstatus mit live gereinigten Neutrophilen. Die entscheidenden Schritte für die Verwendung von MUB40 als Färbung Reagens sind dasselbe wie mit keiner anderen Methode der Fluoreszenz-Detektion. Vorsicht ist geboten, damit Kompatibilität von flu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) und ANR JCJC gewährt (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
