Le Peptide de40 MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à détecter la présence de neutrophiles dans les sections fixes/perméabilisées histologie et évaluer l’état d’activation des neutrophiles purifiées direct. En particulier, le peptide de40 MUB lie la lactoferrine présente dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. Exposition du contenu par perméabilisation ou activation neutrophile granule permet le marquage des neutrophiles.
Abstract
Ici, nous fournissons un protocole impliquant l’utilisation de MUB40, un peptide synthétisé avec le pouvoir de lier la lactoferrine glycosylée stockée à des concentrations élevées dans les granules spécifiques et tertiaires des neutrophiles. Ce détails du protocole comment MUB40 conjugué directement à un fluorophore peuvent être utilisé pour colorer les neutrophiles en fixe/perméabilisées tissus ainsi que la façon dont ceci peut être utilisé dans l’imagerie de cellules vivantes à analyser pour la granulation et activation de neutrophile. Méthodes de détection neutrophiles sont limités à des anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce, qui ne sont pas toujours adaptés pour certaines applications. MUB40 ne pénètre pas la membrane cellulaire et est donc exclu de la lactoferrine stockée dans les neutrophiles non-activé/non-perméabilisées. MUB40 a l’avantage de reconnaître la lactoferrine d’une vaste gamme d’hôtes, ce qui en fait surtout utile pour comparer les résultats dans les études impliquant des modèles de recherche multiple, réduisant le nombre de réactifs en double et en simplifiant les protocoles par la seule étape souillure.
Introduction
Neutrophiles sont une des branches principales du système immunitaire inné et sont systématiquement recrutés aux sites d’inflammation autour du corps. L’étude des neutrophiles a été grandement altérée par leur courte durée de vie in vitro (moins de 8 h) et par les outils de détection limitée dans des conditions basales ou après l’activation. Nous présentons ici un protocole éprouvé pour la détection large et spécifique des neutrophiles mammifères dans les échantillons fixe/perméabilisées. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la coloration des neutrophiles direct avec MUB40. En utilisant le protocole de coloration neutrophil direct, le calendrier et la localisation d’activation neutrophile peuvent être déterminées. Ce protocole est idéal pour les chercheurs qui souhaitent étudier les neutrophile libération d’activation ou de granules. Au-delà de leurs fonctions antimicrobiennes, neutrophiles sont maintenant appréciés comme des immunomodulateurs cellules impliqués dans un large éventail de maladies et de la réponse immunitaire (inné et adaptatif)1,2. Les neutrophiles sont présents dans les tissus inflammatoires plus, à des nombres élevés dans les tissus infectés et dans les tumeurs inflammatoires3, au cours de l’IBS et de Crohn poussées4, dans les zones d’inflammation non infectieuses comme le synovia de polyarthrite rhumatoïde ( Les patients de RA)5. Neutrophiles contiennent des quatre classes de granules préformés nommées azurophiles (α), spécifiques (β1), granules tertiaires (β2) et vésicules de sécrétion (γ)6. Lors de la migration vers un site inflammatoire, neutrophiles recrutés deviennent activés et sécrètent séquentiellement contenu de granule (composé d’adhérence, composés antimicrobiens et molécules immunomodulatrices), qui favorise davantage le recrutement et contribue à infection de résolution (mais aussi à des lésions tissulaires hôte)7. Tandis que les neutrophiles sont considérés comme un aspect essentiel de l’immunité innée, ce jour là sont peu réactifs de détection disponibles à les étudier, et encore moins qui peut être utilisé pour évaluer l’état d’activation des neutrophiles vivant.
Les méthodes actuelles de détection des neutrophiles s’appuient sur des anticorps monoclonaux contre des antigènes exposés de surface cellulaire, comme Ly – 6 G2 ou protéines spécifiquement stockés dans des granules de neutrophiles dans les conditions basales (p. ex., myéloperoxydase la lactoferrine). Avantages des anticorps monoclonaux sont leur forte liaison, une sensibilité et polyvalence dans diverses conditions de test. Cependant, il y a plusieurs inconvénients à l’utilisation des anticorps monoclonaux et anti-Ly – 6G en particulier. Ces inconvénients incluent la spécificité, comme Ly – 6G est présent sur la plupart des cellules myéloïdes dans la moelle osseuse et sur tous les granulocytes notamment éosinophiles ; déchiffrage des neutrophiles d’éosinophiles avec ce marqueur requiert donc8des approches plus complexes. Un autre compromis fréquents avec des anticorps monoclonaux est leur gamme de spécificité d’hôte souvent limité, complique les comparaisons effectuées avec plus d’une espèce animale. Un troisième inconvénient des méthodes de détection d’anticorps, en particulier lors de l’utilisation des cellules vivantes ou in vivo, est leur capacité à perturber la fonction cellulaire ou mènent à l’activation des cellules. Par exemple, l’administration d’anti-Ly – 6G de souris est couramment appliquée à l’appauvrissement de neutrophil et de neutropénie transitoire9. En outre, il a été démontré qu’injection d’anticorps pourrait stimuler la fonction antitumorale neutrophiles10. Enfin, la détection des anticorps des neutrophiles ne révèle pas l’état d’activation de la cellule.
Nous avons identifié un peptide d’acides aminés 40 appelé MUB40, qui peut être utilisé dans un certain nombre d’épreuves pour étiqueter des neutrophiles dans des conditions in vitro ou in vivo ainsi que d’analyse l’état d’activation des neutrophiles direct11. MUB40 est dérivé de MUB7012, un domaine de la protéine liant le mucus de surface de Lactobacillus reuteri décrite à l’origine pour sa capacité à lier les mucus13,14. MUB40 interagit avec la lactoferrine glycosylée qui est présente à des concentrations élevées dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. MUB40 peuvent être exposés à ces granules des étapes perméabilisation standard qui sont présents en histopathologie ou fluorescence-lancée de cellules tri des protocoles (FACS) pour coloration robuste des neutrophiles fixes. Lorsque live neutrophiles sont conservés dans un état inactivé, le peptide de40 MUB est exclu le contenu de granule et cellules tache pas positifs avec le marqueur. Lors de l’activation, MUB40 peut se lier à la lactoferrine exposée et conduire à coloration robuste avec le peptide. Ainsi, MUB40 peut servir à déterminer l’état d’activation des neutrophiles purifiés, ce qui en fait un marqueur attrayant de suivre le processus infectieux. La capacité de liaison aux neutrophiles activés en direct permet également aux MUB40 à être utilisé comme un outil pour détecter les zones d’inflammation neutrophile dans des modèles animaux vivants (par exemple, une souris arthrite modèle15). Les protocoles ce manuscrit en détail comment fluorescent étiqueté MUB40 peuvent être utilisés pour révéler des neutrophiles dans les tissus de l’histologie et comment analyser l’activation des neutrophiles purifiée live in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, deux essais sont décrits dans lequel le peptide de40 MUB est utilisé pour étudier l’activation et l’inflammation neutrophile. Nous montrons comment MUB40 peut révéler des neutrophiles présent dans les sections de l’histopathologie ou montrent leur état d’activation à l’aide de direct neutrophiles purifiées. Les étapes critiques d’utilisation MUB40 comme réactif de coloration sont les mêmes qu’avec n’importe quelle autre méthode de détection par fluoresce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (préstation) et ANR JCJC accorde (ANR-17-CE15-0012) (préstation).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
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