MUB४० पेप्टाइड का पता लगाने में उपयोग के लिए न्युट्रोफिल-मध्यस्थता सूजन की घटनाओं
Summary
यहाँ, हम निश्चित/permeabilized प्रोटोकॉल अनुभागों में न्यूट्रोफिल की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और लाइव शुद्ध न्यूट्रोफिल की सक्रियण स्थिति का आकलन करते हैं. विशेष रूप से, MUB४० पेप्टाइड बांधों लैक्टोफेरिन में मौजूद न्युट्रोफिल-विशिष्ट और तृतीयक granules । या तो permeabilization या न्युट्रोफिल सक्रियण के माध्यम से दाना सामग्री के जोखिम न्यूट्रोफिल के अंकन के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
यहां, हम एक MUB४०, न्यूट्रोफिल के विशिष्ट और तृतीयक granules में उच्च सांद्रता पर संग्रहीत ग्लाइकोसिलेटेड लैक्टोफेरिन बांध करने की क्षमता के साथ एक संश्लेषित पेप्टाइड के उपयोग को शामिल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । यह प्रोटोकॉल विवरण कैसे MUB४० सीधे एक fluorophore करने के लिए संयुग्मित निश्चित/permeabilized ऊतकों में न्यूट्रोफिल दाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से कैसे इस रहते सेल इमेजिंग में न्युट्रोफिल सक्रियकरण और de-दानेदार के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । न्युट्रोफिल पता लगाने के तरीकों प्रजातियों विशेष मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, जो हमेशा कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं करने के लिए सीमित कर रहे हैं । MUB४० कोशिका झिल्ली घुसना नहीं है और इस प्रकार गैर में संग्रहीत लैक्टोफेरिन से बाहर रखा गया है-सक्रिय/गैर permeabilized न्यूट्रोफिल । MUB४० एक व्यापक मेजबान रेंज से लैक्टोफेरिन पहचानने का जोड़ा लाभ है, यह विशेष रूप से कई शोध मॉडल को शामिल करने के अध्ययन में परिणामों की तुलना के लिए उपयोगी बनाने, डुप्लिकेट रिएजेंट की संख्या को कम करने, और प्रोटोकॉल सरल बनाना एकल कदम के माध्यम से धुंधला ।
Introduction
न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के प्राथमिक हथियारों में से एक है और नियमित रूप से शरीर के आसपास सूजन की साइटों के लिए भर्ती कर रहे हैं । न्यूट्रोफिल का अध्ययन काफी हद तक इन विट्रो (8 ज से कम) और बेसल शर्तों के तहत सीमित पता लगाने के उपकरणों के द्वारा या सक्रियण के बाद से ख़राब किया गया है । यहां, हम निश्चित/permeabilized नमूनों में स्तनधारी न्यूट्रोफिल का व्यापक और विशिष्ट पता लगाने के लिए एक अच्छी तरह से परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी MUB४०के साथ लाइव न्यूट्रोफिल धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । लाइव न्युट्रोफिल दाग प्रोटोकॉल का उपयोग करना, समय और न्युट्रोफिल सक्रियण के स्थान को इंगित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो न्युट्रोफिल सक्रियकरण या दाना रिहाई का अध्ययन करना चाहते है के लिए आदर्श है । उनके रोगाणुरोधी कार्यों के अलावा, न्यूट्रोफिल अब रोगों और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कोशिकाओं के रूप में सराहना कर रहे हैं (सहज और अनुकूली)1,2. न्यूट्रोफिल सबसे भड़काऊ ऊतकों में मौजूद हैं, संक्रमित ऊतकों में उच्च संख्या में, भड़काऊ ट्यूमर3में, आईबीएस और Crohn भड़क अप4के दौरान, और गैर संक्रामक सूजन के क्षेत्रों में ऐसे रुमेटी गठिया के synovia के रूप में ( रा) रोगियों5. न्यूट्रोफिल में azurophil (α), विशिष्ट (β1), तृतीयक (β2) granules, और स्रावी बुलबुले (γ)6नामक पूर्व-निर्मित granules की चार कक्षाएं शामिल हैं । एक भड़काऊ साइट के लिए प्रवास पर, भर्ती न्यूट्रोफिल सक्रिय हो जाते हैं और क्रमिक रूप से granules सामग्री (आसंजन, रोगाणुरोधी यौगिकों और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं से बना), जो आगे भर्ती को बढ़ावा देता है और योगदान करने के लिए संक्रमण संकल्प (लेकिन यह भी ऊतक क्षति होस्ट करने के लिए)7. जबकि न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा का एक महत्वपूर्ण पहलू माना जाता है, तारीख करने के लिए वहां कुछ पता लगाने के लिए उंहें अध्ययन उपलब्ध एजेंट हैं, और भी कम है कि न्यूट्रोफिल रहने वाले सक्रियण राज्य का आकलन किया जा सकता है ।
न्यूट्रोफिल का पता लगाने के वर्तमान तरीकों मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सेल के खिलाफ उत्पन्न-सतह उजागर एंटीजन, जैसे कि 6G2 या प्रोटीन विशेष रूप से बेसल शर्तों के तहत न्युट्रोफिल granules में संग्रहीत (जैसे, myeloperoxidase , लैक्टोफेरिन) । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लाभ उनके मजबूत बाध्यकारी, संवेदनशीलता, और विभिंन परख शर्तों के तहत बहुमुखी प्रतिभा शामिल हैं । हालांकि, विशेष रूप से मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और विरोधी-6G का उपयोग करने के लिए कई नकारात्मक पक्ष हैं । इन नकारात्मक पक्ष विशिष्टता शामिल हैं, के रूप में 6G अस्थि मज्जा में माइलॉयड कोशिकाओं के बहुमत पर मौजूद है और इयोस्नोफिल्स सहित सभी granulocytes पर उपस्थित है; इस प्रकार, इस मार्कर के साथ इयोस्नोफिल्स से न्यूट्रोफिल गूढ़ और अधिक परिसरों8दृष्टिकोण की आवश्यकता है । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक और लगातार tradeoff अपने अक्सर सीमित मेजबान विशिष्टता रेंज है, एक से अधिक पशु प्रजातियों के साथ तुलना अध्ययन मुश्किल बना । एंटीबॉडी का पता लगाने के तरीकों का एक तीसरा दोष, विशेष रूप से जब जीवित कोशिकाओं का उपयोग या vivo में, उनके सेल समारोह को बाधित या सेल सक्रियण के लिए नेतृत्व करने की क्षमता है । उदाहरण के लिए, एंटी-6G के प्रशासन चूहों को आमतौर पर न्युट्रोफिल कमी और क्षणिक न्यूट्रोपेनिया9करने के लिए लागू किया जाता है. यह इसके अतिरिक्त प्रदर्शन किया गया है कि एंटीबॉडी इंजेक्शन न्युट्रोफिल अर्बुदरोधी10समारोह को उत्तेजित कर सकते हैं । अंतत:, न्यूट्रोफिल के एंटीबॉडी डिटेक्शन कक्ष की सक्रियण स्थिति प्रकट नहीं होता है ।
हम एक ४०-एमिनो एसिड पेप्टाइड की पहचान की है बुलाया MUB४०, जो एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है परख के तहत न्यूट्रोफिल में इन विट्रो या vivo स्थितियों में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जी न्यूट्रोफिल11के सक्रियकरण स्थिति परख । MUB४० MUB७०12से व्युत्पंन है, लैक्टोबैसिलस reuteri सतह बलगम के एक डोमेन-बाध्यकारी प्रोटीन मूल रूप से अपने बलगम13,14बांध करने की क्षमता के लिए वर्णित है । MUB४० न्युट्रोफिल-विशिष्ट और तृतीयक granules में उच्च सांद्रता पर मौजूद है कि ग्लाइकोसिलेटेड लैक्टोफेरिन के साथ इंटरैक्ट करता है । MUB४० मानक permeabilization histopathology या प्रतिदीप्ति में मौजूद कदम के माध्यम से इन granules को उजागर किया जा सकता है-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) स्थिर न्यूट्रोफिल के मजबूत धुंधला के लिए प्रोटोकॉल । जब लाइव न्यूट्रोफिल एक निष्क्रिय राज्य में रखा जाता है, MUB४० पेप्टाइड granules सामग्री से बाहर कर दिया है, और कोशिकाओं मार्कर के साथ सकारात्मक दाग नहीं है । सक्रियण पर, MUB४० उजागर लैक्टोफेरिन को बांध और पेप्टाइड के साथ मजबूत धुंधला करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, MUB४० शुद्ध न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण राज्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह एक आकर्षक मार्कर के लिए संक्रामक प्रक्रिया का पालन कर । सक्रिय न्यूट्रोफिल जीने के लिए बांध करने की क्षमता भी MUB४० एक उपकरण के लिए जीवित पशु मॉडल में न्युट्रोफिल सूजन के क्षेत्रों का पता लगाने के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है (जैसे, एक माउस गठिया मॉडल15) । इस पांडुलिपि विस्तार में प्रोटोकॉल कैसे फ्लोरोसेंट MUB४० लेबल प्रोटोकॉल ऊतकों में न्यूट्रोफिल प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कैसे परख करने के लिए रहते है इन विट्रो मेंशुद्ध न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, दो परख वर्णित है जिसमें MUB४० पेप्टाइड न्युट्रोफिल सूजन और सक्रियण अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हम बताएंगे कि कैसे MUB४० histopathology वर्गों में मौजूद न्यूट्रोफिल प्रकट कर सकते हैं या उन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के शौकीनों लौरेट Fugain (वामो-2015-15) (B.S.M.) और ANR JCJC पलाश (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
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