MUB40 peptid for bruk i å oppdage nøytrofile-mediert betennelse hendelser
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage tilstedeværelsen av nøytrofile i fast/permeabilized histology deler og vurdere aktiveringsstatusen for live renset nøytrofile. Spesielt binder MUB40 peptid Laktoferrin i nøytrofile-spesifikke og tertiær granulat. Eksponering av granule innholdet via permeabilization eller nøytrofile Aktivering muliggjør merking av nøytrofile.
Abstract
Her gir vi en protokoll med bruk av MUB40, et syntetisk peptid muligheten til å binde glycosylated Laktoferrin lagret i høy konsentrasjoner i bestemte og tertiær granulater av nøytrofile. Denne protokollen detaljer hvordan MUB40 konjugert direkte til en fluorophore kan brukes stain nøytrofile fast/permeabilized vev samt hvordan dette kan brukes i live-celle imaging til analysen for nøytrofile aktivisering og de korning. Nøytrofile gjenkjenningsmetoder er begrenset til artsspesifikke monoklonale antistoffer, som ikke alltid egnet for bestemte programmer. MUB40 trenge ikke cellemembranen og er derfor utelukket fra Laktoferrin lagret i ikke-aktivert/ikke-permeabilized nøytrofile. MUB40 har den ekstra fordelen av å gjenkjenne Laktoferrin fra et bredt vert område, slik at det er spesielt nyttig for å sammenligne resultatene i studier som involverer flere forskning modeller, reduserer like reagenser og forenkle protokoller gjennom enkeltsteg flekker.
Introduction
Nøytrofile er en av de primære våpen av det medfødte immunsystemet og rekrutteres rutinemessig til nettstedene til betennelse rundt i kroppen. Studiet av nøytrofile har vært i stor grad svekket ved deres kort lifespan i vitro (mindre enn 8 timer) og begrenset gjenkjenningsverktøy basale vilkår eller etter aktivering. Her presenterer vi en godt testet protokoll for bred og konkret påvisning av pattedyr nøytrofile i fast/permeabilized prøver. Vi tilbyr også en detaljert protokoll til farging live nøytrofile MUB40. Bruker live nøytrofile flekker protokollen, kan tidsberegningen og plasseringen av nøytrofile aktivisering bli rettet. Denne protokollen er ideell for forskere som ønsker å studere nøytrofile aktivisering eller granule utgivelsen. Utover deres antimicrobial funksjoner er nøytrofile nå verdsatt som immunmodulerende celler involvert i en rekke sykdommer og immunreaksjoner (medfødte og adaptive)1,2. Nøytrofile er tilstede i mest provoserende vev, på høye tall i infiserte vev, inflammatorisk svulster3, under IBS og Crohns flare-ups4, og områder av ikke-smittsomme betennelser som synovia av revmatoid artritt ( RA) pasienter5. Nøytrofile inneholder fire klasser av pre-formet granulater azurophil (α), spesifikke (β1), tertiær (β2) granulater og sekretoriske blemmer (γ)6. Overføring til et provoserende rekruttert nøytrofile bli aktivert og skiller sekvensielt granule innholdet (komponert av vedheft, antimikrobielle forbindelser og immunmodulerende molekyler), som fremmer videre rekruttering og bidrar til infeksjon oppløsning (men også til vert vevsskade)7. Mens nøytrofile anses en kritisk del av medfødt immunitet, ennå det er få oppdagelsen reagenser tilgjengelig å studere dem, og enda færre som kan brukes til å vurdere aktiveringsstatusen for levende nøytrofile.
Gjeldende metoder av oppdager nøytrofile er avhengige av monoklonale antistoffer generert mot celle-overflate eksponert antigener, for eksempel Ly – 6 G2 eller proteiner spesielt lagret i nøytrofile granulater under basale forhold (f.eks myeloperoxidase lactoferrin). Fordelene av monoklonale antistoffer inkluderer sine sterke bindende, følsomhet og allsidighet under ulike analysen forhold. Det er imidlertid flere downsides å benytter monoklonale antistoffer og anti-Ly – 6G spesielt. Disse ulempene inkluderer spesifisitet, som Ly – 6G finnes på et flertall av myeloide celler i beinet margtransplantasjon og på alle granulocytter inkludert eosinofile; dermed krever tyde nøytrofile fra eosinofile med dette merket flere komplekser tilnærminger8. En annen hyppige bakdelen med monoklonale antistoffer er deres ofte begrenset vert spesifisitet, gjør sammenligning studier med flere dyrearter vanskelig. En tredje ulempen av antistoff gjenkjenningsmetoder, spesielt når du bruker live celler eller i vivo, er deres potensial til å forstyrre funksjonen celle eller føre til celle aktivering. Administrasjonen av anti-Ly – 6G til mus brukes for eksempel ofte til nøytrofile uttømming og forbigående nøytropeni9. Det har i tillegg blitt demonstrert at antistoff injeksjon kan stimulere nøytrofile antitumor funksjonen10. Til slutt avslører ikke antistoff påvisning av nøytrofile aktiveringsstatusen for cellen.
Vi har identifisert en 40-amino acid peptid kalt MUB40, som kan brukes i en rekke analyser etiketten nøytrofile under i vitro eller vivo forhold samt analysen aktiviseringen rang av live nøytrofile11. MUB40 er avledet fra MUB7012, et domene av Lactobacillus reuteri overflaten Slim-bindende protein opprinnelig beskrevet for sin evne til å binde Slim13,14. MUB40 samhandler med glycosylated Laktoferrin som finnes i høy konsentrasjoner i nøytrofile-spesifikke og tertiær granulat. MUB40 kan bli utsatt for disse granulater gjennom standard permeabilization trinnene i histopatologi eller fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) protokoller for robust farging av fast nøytrofile. Når live nøytrofile beholdes i deaktivert tilstand MUB40 peptid er utelukket fra granule innholdet og cellene flekker ikke positivt med markøren. Ved aktivering, kan MUB40 binde til utsatte Laktoferrin og føre til robust farging med peptid. MUB40 kan dermed brukes til å bestemme aktiveringsstatusen for renset nøytrofile, noe som gjør det til et attraktivt markør følge smittsomme prosessen. Muligheten til å binde til live aktivert nøytrofile kan også MUB40 skal brukes som et verktøy for å oppdage områder av nøytrofile betennelse i levende dyr modeller (f.eks en mus leddgikt modell15). Protokollene i dette manuskriptet detalj hvordan fluorescently merket MUB40 kan brukes å avsløre nøytrofile histology vev og hvordan analysen aktivering av live renset nøytrofile i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her er to analyser beskrevet som MUB40 peptid brukes til å studere nøytrofile betennelse og aktivisering. Vi viser hvordan MUB40 kan avsløre nøytrofile presentere i histopatologi deler eller vise deres aktiveringsstatus bruker live renset nøytrofile. De avgjørende skritt for å bruke MUB40 som en flekker reagens er den samme som med andre fluorescerende oppdagelsen metoden. Hensyn må tas for å sikre kompatibilitet med fluorescerende signaler og at tilstrekkelig vask skritt er tatt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) og ANR JCJC gir (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
