O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de40 MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.
Abstract
Aqui, nós fornecemos um protocolo que envolve a utilização de MUB40, um peptídeo sintetizado com a capacidade de se ligar a lactoferrina glicosilados armazenada em concentrações elevadas em grânulos específicos e terciários de neutrófilos. Este detalhes de protocolo como MUB40 conjugado diretamente com um fluoróforo pode ser usado para manchar os neutrófilos nos tecidos fixo/permeabilizado, bem como a forma como isso pode ser usado em imagens de viver-pilha a ensaiar para a granulação e ativação de neutrófilos. Métodos de deteção dos neutrófilos são limitados a espécie anticorpos monoclonais, que nem sempre são adequados para determinadas aplicações. MUB40 não penetra a membrana celular e, portanto, é excluído da lactoferrina armazenada em neutrófilos não-ativado/não-permeabilizado. MUB40 tem o benefício adicionado de reconhecer lactoferrina de um leque amplo acolhimento, tornando-se especialmente útil para comparar resultados em estudos envolvendo vários modelos de pesquisa, reduzindo o número de reagentes duplicados e simplificando os protocolos através de coloração de etapa única.
Introduction
Os neutrófilos são um dos principais braços do sistema imune inato e rotineiramente são recrutados para os locais de inflamação ao redor do corpo. O estudo de neutrófilos foi em grande parte prejudicado por sua vida curta em vitro (menos de 8 h) e ferramentas de detecção limitada em condições basais ou após a ativação. Aqui, apresentamos um protocolo bem testado para a detecção de amplo e específico de neutrófilos mamíferos em amostras fixas/permeabilizado. Nós também fornecemos um protocolo detalhado para coloração de neutrófilos ao vivo com MUB40. Usando o protocolo de coloração dos neutrófilos ao vivo, o calendário e a localização da ativação de neutrófilos podem ser identificados. Este protocolo é ideal para os investigadores que desejem estudar a liberação de ativação ou grânulos neutrófilos. Além de suas funções antimicrobianas, neutrófilos agora são apreciados como imunomodulador células envolvidas em uma ampla gama de doenças e respostas imunes (inata e adaptativa)1,2. Os neutrófilos estão presentes em tecidos mais inflamatórios, em números elevados em tecidos infectados, em tumores inflamatórios3, durante a IBS e Crohn flare-ups4e em áreas de inflamação não-infecciosa, tais como a sinóvia de artrite reumatoide ( RA) pacientes5. Os neutrófilos contêm quatro classes de grânulos pré-formados, chamado azurophil (α), específicas (β1), grânulos de terciário (β2) e vesículas secretoras (γ)6. Após a migração para um site inflamatória, recrutados os neutrófilos se tornar ativados e sequencialmente secretam grânulo conteúdo (composto por adesão, compostos antimicrobianos e imunomoduladores moléculas), que promove ainda mais recrutamento e contribui para infecção de resolução (mas também de danos aos tecidos do hospedeiro)7. Enquanto os neutrófilos são considerados um aspecto crítico da imunidade inata, até à data, lá são alguns reagentes de detecção disponíveis para estudá-los, e ainda menos que pode ser usado para avaliar o estado de ativação de neutrófilos vivos.
Atuais métodos de detecção de neutrófilos dependem de anticorpos monoclonais gerados contra antígenos de superfície expostos, como Ly – 6G2 ou proteínas especificamente armazenadas nos grânulos neutrófilos em condições basais (por exemplo, mieloperoxidase lactoferrina). Vantagens de anticorpos monoclonais incluem sua forte ligação, sensibilidade e versatilidade em diversas condições de ensaio. No entanto, existem várias desvantagens ao uso de anticorpos monoclonais e anti-Ly – 6G em particular. Essas desvantagens incluem a especificidade, como Ly – 6G está presente na maioria das células mieloides, na medula óssea e em todos os granulócitos incluindo eosinófilos; Portanto, decifrar os neutrófilos de eosinófilos com este marcador requer mais complexos se aproxima de8. Outra troca frequente com anticorpos monoclonais é sua gama de especificidade de hospedeiros muitas vezes limitada, dificultando estudos de comparação com mais de uma espécie animal. Uma terceira desvantagem dos métodos de detecção de anticorpos, especialmente quando se utiliza células vivas ou in vivo, é o seu potencial para perturbar a função celular ou levar a ativação de células. Por exemplo, a administração de anti-Ly – 6G para ratos é comumente aplicada a depleção de neutrófilos e neutropenia transitória9. Além disso foi demonstrado que a injeção de anticorpos pode estimular neutrófilos função antitumoral10. Finalmente, pesquisa de anticorpos de neutrófilos não revela o estado de ativação da célula.
Nós identificamos um 40-amino peptídeo ácido chamado MUB,40, que pode ser usado em um número de ensaios para rotular os neutrófilos em condições em vitro e em vivo , bem como o status de ativação de neutrófilos ao vivo11de ensaios. MUB40 é derivado de MUB7012, um domínio do Lactobacillus reuteri superfície muco-proteína originalmente descrita por sua capacidade de vincular o muco13,14. MUB40 interage com lactoferrina glicosilados que está presente em altas concentrações em grânulos neutrófilos específicos e terciários. MUB40 pode ser exposto a estes grânulos através de etapas de permeabilização padrão presentes na histopatologia ou fluorescência-ativado da pilha protocolos (FACS) para coloração robusto de neutrófilos fixos de classificação. Quando os neutrófilos ao vivo são mantidos em um estado inativado, o peptídeo de40 MUB é excluído do conteúdo do grânulo, e células não mancha positivas com o marcador. Após a ativação, MUB40 pode vincular a lactoferrina exposta e levar a coloração robusto com o peptídeo. Assim, MUB40 pode ser usado para determinar o estado de ativação de neutrófilos purificados, tornando-se um marcador atraente para seguir o processo infeccioso. A capacidade de se ligar a viver os neutrófilos ativados também permite MUB40 ser usado como uma ferramenta para detectar áreas de inflamação dos neutrófilos em modelos animais vivos (por exemplo, um rato artrite modelo15). Os protocolos detalhadamente este manuscrito como fluorescente etiquetado MUB40 podem ser usados para revelar os neutrófilos em histologia tecidos e como a ensaiar a ativação de neutrófilos purificado ao vivo em vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, dois ensaios são descritos em que o peptídeo de40 MUB é usado para estudar a ativação e inflamação dos neutrófilos. Mostramos como MUB40 pode revelar os neutrófilos presentes nas seções de histopatologia ou mostram seu estado de ativação usando neutrófilos purificados ao vivo. As etapas críticas para usar MUB40 como um reagente de coloração são os mesmos que com qualquer outro método de deteção fluorescente. Deve ter cuidado para garantir a compatibilidade de si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fondation Laurette Fugain (se-2015-15) (B.S.M.) e ANR JCJC concede (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
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