SNAJDARN240 peptiden för användning i att upptäcka neutrofiler-medierad Inflammation händelser
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka förekomsten av neutrofiler i fasta/permeabilized histologi sektioner och bedöma aktivering av levande renat neutrofiler. I synnerhet binder SNAJDARN240 peptiden Laktoferrin närvarande i neutrofiler-specifika och tertiär granulat. Exponering av granule innehållet antingen genom permeabilisering eller neutrofil aktivering möjliggör märkning av neutrofiler.
Abstract
Här, tillhandahåller vi ett protokoll som inbegriper användning av SNAJDARN240, en syntetiserade peptid med förmågan att binda glykosylerat Laktoferrin lagras vid höga koncentrationer i specifika och tertiär granulat av neutrofiler. Detta protokolldetaljer hur SNAJDARN240 konjugerat direkt till en fluorophore kan användas för att färga neutrofiler i fasta/permeabilized vävnader samt hur detta kan användas i live-cell imaging till assay för neutrofil aktivering och avinstallation granulering. Neutrofila detekteringsmetoderna är begränsad till artspecifika monoklonala antikroppar, som inte alltid är lämpliga för vissa applikationer. SNAJDARN240 tränger inte cellmembranet och är därmed undantagna från Laktoferrin lagras i icke-aktiverad/icke-permeabilized neutrofiler. SNAJDARN240 har fördelen av att erkänna Laktoferrin från ett brett spektrum, vilket gör det särskilt användbart för att jämföra resultaten i studier med flera forskningsmodeller, att minska antalet duplicerade reagenser och förenkla protokoll genom steg färgning.
Introduction
Neutrofiler är en av de primära vapen av det medfödda immunsystemet och rekryteras rutinmässigt till platser i inflammation runt kroppen. Studien av neutrofilerna har varit i hög grad nedsatt genom sin korta livslängd i vitro (mindre än 8 h) och begränsad identifieringsverktyg under basala förhållanden eller efter aktiveringen. Här presenterar vi en väl testad protokoll för den breda och specifikt påvisande av däggdjur neutrofiler i fasta/permeabilized prover. Vi ger också ett detaljerat protokoll för färgning levande neutrofiler med SNAJDARN240. Genom att använda protokollet för levande neutrofila färgning, kan tidpunkten och platsen för neutrofil aktivering vara identifierat. Detta protokoll är idealisk för forskare som vill studera neutrofil aktivering eller granule release. Bortom deras antimikrobiella funktioner uppskattas nu neutrofiler som immunmodulerande celler involverade i ett stort antal sjukdomar och immunsvar (medfödd och adaptiv)1,2. Neutrofiler är närvarande i den inflammatoriska vävnader, på kicken numrerar i infekterade vävnader, i inflammatoriska tumörer3, under IBS och Crohns flare-ups4, och i områden av icke-infektiös inflammation såsom synovia av reumatoid artrit ( RA) patienter5. Neutrofiler innehåller fyra klasser redan bildade granulat heter azurophil (α), specifika (β1), tertiär (β2) granulat och sekretoriska vesiklar (γ)6. Vid migrering till en inflammatorisk webbplats, rekryteras neutrofiler aktiveras och utsöndrar sekventiellt granule tillfredsställer (bestående av vidhäftning, antimikrobiella föreningar och immunmodulerande molekyler), som främjar ytterligare rekrytering och bidrar till infektion resolution (men även till värd vävnadsskada)7. Medan neutrofiler anses vara en viktig aspekt av den medfödda immuniteten, hittills det är några upptäckt reagenser tillgängliga att studera dem, och ännu färre som kan användas för att bedöma tillståndet aktivering av levande neutrofiler.
Nuvarande metoder för att upptäcka neutrofiler lita på monoklonala antikroppar genereras mot cellytan exponerade antigener, såsom Ly – 6 G2 eller proteiner specifikt lagras i neutrofila granulat under basala förhållanden (t.ex. myeloperoxidas Laktoferrin). Fördelarna med monoklonala antikroppar är deras starka bindning, känslighet och mångsidighet olika assay villkor. Dock finns det flera nackdelar med att använda monoklonala antikroppar och anti-Ly – 6G i synnerhet. Dessa nackdelar inkluderar specificitet, Ly – 6G är närvarande på en majoritet av myeloida celler i benmärgen och på alla granulocyter inklusive eosinofiler; dechiffrera neutrofiler från eosinofiler med denna markör kräver alltså, mer komplex närmar sig8. En annan frekvent nackdelen med monoklonala antikroppar är deras ofta begränsad specificitet spektrum försvårar jämförelsen studier med mer än en djurart. En tredje nackdel av antikropp detektionsmetoder, särskilt när användande levande celler eller in vivo, är deras potential att störa cellernas funktion eller leda till cellaktivering. Exempelvis är administrationen av anti-Ly – 6G till möss vanligen tillämpas på neutrofila utarmning och övergående neutropeni9. Det har dessutom visat att antikroppen injektion kan stimulera neutrofila antitumöreffekt funktion10. Påvisande av antikroppar av neutrofiler avslöjar slutligen inte tillståndet aktivering av cellen.
Vi har identifierat en 40-amino acid peptid som kallas SNAJDARN240, som kan användas i ett antal analyser till etikett neutrofiler in vitro- eller in-vivo villkor samt assay aktiveringen ställningen av levande neutrofiler11. SNAJDARN240 härleds från SNAJDARN27012, en domän av Lactobacillus reuteri ytan slem-bindande protein ursprungligen beskrevs för dess förmåga att binda slem13,14. SNAJDARN240 interagerar med glykosylerat Laktoferrin som är närvarande vid höga koncentrationer i neutrofiler-specifika och tertiär granulat. SNAJDARN240 kan utsättas för dessa granulat genom standard vilket steg i histopatologi eller fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) protokoll för robust färgning av fasta neutrofiler. När levande neutrofiler hålls i ett inaktiverat tillstånd, SNAJDARN240 peptiden utesluts från granule innehållet och celler fläckar inte positivt med markören. Vid aktivering, kan SNAJDARN240 binda till exponerade Laktoferrin och leda till robust färgning med peptiden. SNAJDARN240 kan således användas för att avgöra aktiveringstillstånd för renat neutrofiler, vilket gör det till en attraktiv markör att följa smittsamma processen. Förmågan att binda till live-aktiverade neutrofiler kan också SNAJDARN240 att användas som ett verktyg för att identifiera områden av neutrofil inflammation i levande djurmodeller (t.ex. en mus artrit modell15). Protokollen i denna manuskriptet detalj hur fluorescently märkt SNAJDARN240 kan användas för att avslöja neutrofiler i histologi vävnader och hur till assay aktivering av levande renat neutrofiler i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs två analyser där SNAJDARN240 peptiden används för att studera neutrofil inflammation och aktivering. Vi visar hur SNAJDARN240 kan avslöja neutrofiler föreligger i histopatologi sektioner eller visa sin aktiveringstillstånd att använda levande renat neutrofiler. De kritiska steg för att använda SNAJDARN240 som en färgning reagens är samma som med alla andra fluorescerande detektionsmetod. Var noga med att säkerställa kompatibilitet av fluorescerande signaler och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) och ANR JCJC bidrag (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
