Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול זמן לשגות morphometric לעקוב האינטנסיביות של הבלסטוציסט התכווצות והתרחבות re במהלך התערבויות previtrification ושחזור פוסט-התחממות כדור הארץ. היישום של הפרוטוקול אפשרי במבחנה מעבדות הפריה מצויד מיקרוסקופים בצילום מואץ והוא מומלץ בפיתוח של שיטת ויטריפיקציה הבלסטוציסט אופטימלית.
Abstract
מאמר זה מתאר את השיטה לא פולשנית של הבלסטוציסט morphometry מבוסס על זמן לשגות microphotography עבור ניטור מדויק של אמצעי אחסון של הבלסטוציסט שינוי במהלך שלבים בודדים לפני ואחרי ויטריפיקציה. השיטה יכולה להיות שימושית בחיפוש אחר הזמן האופטימלי ביותר של חשיפה הבלסטוציסט ריכוזים שונים של cryoprotectants על ידי התבוננות הבלסטוציסט הצטמקות, re-הרחבה שונים מראש, שלאחר ויטריפיקציה שלבים. עם מתודולוגיה זו, ניתן למטב את פרוטוקול ויטריפיקציה הבלסטוציסט. לקבלת הדגמה טובה יותר של התועלת של שיטה זו morphometric, מושווים שני פרוטוקולים הכנה הבלסטוציסט שונים עבור ויטריפיקציה; אחד עם שימוש של blastocoel מלאכותיים כיווץ ואחד ללא התערבות זו לפני ויטריפיקציה. שניהם שינויי נפח של blastocysts ואחריו microphotography זמן לשגות, נמדדת כלי תוכנה לעריכת תמונות. המדידות נלקחים בכל 20 שניות בשלבים previtrification של כל 5 דקות בתקופה שלאחר התחממות כדור הארץ. השינויים של הממדים הבלסטוציסט ליחידת הזמן מוצגים בצורה גרפית בדיאגרמות קו. התוצאות מציגות שלב previtrification equilibration ארוך בו הבלסטוציסט ללא פגע קודם מכווץ, ואז לאט לאט מילוי blastocoel, הזנת ויטריפיקציה עם blastocoel מלאות נוזל. הבלסטוציסט המצומצם באופן מלאכותי נשארת בשלבי מכווצים באמצעות שלב equilibration כולו. במהלך שלב ויטריפיקציה, זה גם לא משנה הנפח שלה. מאז morphometry הבלסטוציסט מראה נפח קבוע של blastocysts באופן מלאכותי התמוטט במהלך השלב previtrification, נראה כי בשלב זה יכול להיות קצר יותר. פרוטוקול המתואר מספק פרמטרים רבים נוספים השוואתי בהתנהגות הבלסטוציסט במהלך ואחרי הקפאה קריוגנית על בסיס המהירות ואת עוצמת השינויים אמצעי האחסון, מספר ההתכווצויות blastocoel חלקית או מוחלטת הבלסטוציסט מכווץ, הזמן הכולל blastocoel re-הרחבה או זמן הבקיעה.
Introduction
הקפאה קריוגנית של עוברי של אדם מתוכנית במבחנה הפריה (IVF) היא כיום אימון שגרתי במעבדות IVF רוב. העובר איטי הקפאת שיטת החל להיות בשימוש קליני בשנת 1985, עם כניסתה של cryoprotectants ספציפיים ומקפיאים מבוקרת מחשב, שאיפשר הקירור מבוקרת של עוברי ל-7 מעלות צלזיוס, כאשר התגרענות קרח (זריעה) הושרה ב סביב cryoprotective בינוני1. על ידי קירור רציפה, יגדלו גבישי הקרח, גורם את hyperosmolality של השבר נוזלי הנותרים, וכתוצאה מכך להתייבשות, הצטמקות של תאים עובריים. למינוס 30 מעלות או-80 ° C, העוברים ההיסחפות לתוך החנקן הנוזלי לאחסון ארוך יותר. מה קורה עם עוברי או oocytes במהלך הקירור יכול להיות שנצפו רק על ידי הותאם במיוחד cryomicroscopes, אשר סייע לשפר הקפאה קריוגנית פרוטוקולים2. להקפאת blastocysts, נפח-גבוה יותר, בשלב העוברי הכיל-נוזל יותר, נתן פחות מבטיח תוצאות קליניות בימים האלה3.
פריצת הדרך ב הקפאה קריוגנית של הבלסטוציסט היה כניסתה של שיטת ויטריפיקציה, אשר להתייבשות של התאים התרחשה לפני קירור באמצעות ריכוזים גבוהים של cryoprotectants4. הסרת הנוזלים blastocoel לפני ויטריפיקציה גם יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע פתיחה מכנית בין trophectoderm שני תאים5. למרות שיעור ההישרדות של הבלסטוציסט מיידית לאחר ויטריפיקציה ומחמם הוא מעל 90%, ואת הבאות התוצאה הקלינית בהעברת הבלסטוציסט vitrified/חימם לתוך חלל הרחם הוא כמעט להשוות תוצאות לאחר ההעברה של טרי עוברי, שיטה זו הקפאה קריוגנית טרם בוטלה מתוקננת6,7. ויטריפיקציה פרוטוקולים משתנים בהתאם ריכוז cryoprotectants, (ב) מספר צעדים previtrification, (ג) משך הזמן של צעדים בודדים, (ד) שימוש blastocoel מלאכותי כיווץ לפני ויטריפיקציה או לא, וסוג (א) (e). קורס שיטות (נ) הרחבת הבלסטוציסט הבמה, (g) הטמפרטורה equilibration/ויטריפיקציה ב. שאמור להיות העוברים vitrified8. מאז cryoprotectants יכול להיות רעיל עבור תאים, זמן חשיפה הבלסטוציסט פתרונות אלו חייב להיות מוגדרת היטב. עם זאת, חלק מיצרני מדיה הקפאה קריוגנית לאפשר פרוטוקולים מאוד גמיש.
האינטרס של מדענים מתמקדת בדרך כלל לימוד היכולת re-הרחבת הבלסטוציסט במטרה למצוא סמנים ביולוגיים חדש עם חיזוי טוב יותר של ההשתלה6,9,10. איך blastocysts האנושי מייבשים-שלבים שונים של הוספת cryoprotectants לפני ויטריפיקציה, מה קורה עם blastocysts לאחר ויטריפיקציה ומחמם, כאשר cryoprotectants יש להסיר את התאים, איך להחזיר blastocysts נוזלים, להרחיב מחדש לאחר התחממות כדור הארץ, הוא לא היטיב לתאר ולא מובן. פיתוח מתודולוגיה המטרה וניטור כימות של הבלסטוציסט התנהגות במהלך שלבים שונים הקפאה קריוגנית היא, לפיכך, הרציונל.
עם מיקרוסקופים בצילום מואץ של יצרנים שונים, עכשיו זה אפשרי לנטר את ההתנהגות של הבלסטוציסט ב טרום ואת פוסט-ויטריפיקציה שלבים. על-ידי הכללת מחשב נוסף כלים, מדידות של גודלם (morphometry) ניתן גם לבצע. על ידי מדידת הירידה או להגביר את גודל העובר בזמן נתון, ניתן לבחון את ההערכה של morphodynamics של העוברים במהלך התייבשות, התייבשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה הרפואית הלאומית על אפריל 19 2016 (מס ' 0120-204/2016 – 2).
1. הקמה של מערכת הקלטה מיקרוסקופ
- כבה את הצלחת חימום של המיקרוסקופ.
- לפני כל טיפול, לקחת תמונה של הבלסטוציסט תחת מיקרוסקופ הפוכה מצויד במצלמה. זכור לציין ההגדלה בה הוקלט על הבלסטוציסט.
2. מבחר, Prepreparation של Blastocysts עבור ויטריפיקציה
- בחר blastocysts מורחבת במלואה רק יום-5 או 6-יום עבור הקפאה קריוגנית לפחות כמה תאים (ICM) מסת התא הפנימי, trophectoderm מלוכדת.
- עבור blastocysts שטופלו לייזר עם blastocoel התמוטט, הנושא הבלסטוציסט כדי פולס לייזר קצר (0.4 - 0.7 ms) עם חור בקוטר הנע בין 4.3 9.4 מיקרומטר, tangentially ביים את pellucida zona ועל צומת של שני תאים סמוכים trophectodermal. לאפשר את הבלסטוציסט להתמוטט באופן מלא או חלקי במשך 5 דקות.
- עבור blastocysts לא מטופל עם blastocoel ללא פגע, לבצע שום טיפול מסוים לפני ויטריפיקציה.
הערה: blastocysts אלה נחשבים ללא פגע.
3. הכנת Cryoprotectant, צלחת פטרי לשלב Equilibration
- שימוש pithe פיפטה עבור חסיפה oocyte (קוטר 135 מיקרומטר) למלא גילוח ורחיצה כירורגית equilibration מדיה (M-199 באגירה HEPES בינוני עם 7.5% דימתיל סולפוקסיד, 7.5% אתילן גליקול, 20% DSS) לתוך החורים של אזור microdroplet של 9-ובכן פטרי תוכנן במיוחד עבור הקלטה של מיקרוסקופיית זמן לשגות.
הערה: Oocyte חסיפה הוא תהליך של הסרת cumulus התאים המקיפים את oocyte. השימוש פיפטה oocyte חסיפה יסייע למנוע היצירה של בועות אוויר. - כיסוי האזור microdroplet עם 30 µL של התקשורת equilibration.
4. העברת הבלסטוציסט בתמיסה Equilibration
- להטביע של הבלסטוציסט שטופלו לייזר או בשלמותם לתוך האמצעי equilibration לחלק התחתון של האזור microdroplet של המנה microdroplet 10 דקות בטמפרטורת החדר (שלב equilibration).
- התחל ספירה לאחור 10 דקות ברגע הבלסטוציסט מועבר למדיום equilibration.
5. רישום של הבלסטוציסט בשלב Equilibration
- להעביר את המנה microdroplet עם הבלסטוציסט מיקרוסקופ מצויד במצלמה. השתמש ההגדלה אותו כאמור לקחת תמונה של הבלסטוציסט אותו. המיקום microdroplet מגישים כך הבלסטוציסט ממוקם במרכז ההקלטה.
- . תתחיל להקליט עם המיקרוסקופ הקלטה תוכנה הערה משך הספירה לאחור שבה התחיל את ההקלטה.
הערה: ראה תוצאות נציג של הקלטות של שלם (איור 1, 1 וידאו), של הבלסטוציסט מכווצת (איור 2, סרטון 2) במהלך החשיפה 10 דקות כדי פתרון equilibration.
6. ויטריפיקציה של הבלסטוציסט
- גילוח ורחיצה כירורגית לוותר על טיפת 50-µL פתרון ויטריפיקציה (M-199 באגירה HEPES בינוני עם דימתיל סולפוקסיד 15%, 15% אתילן גליקול, 20% DSS, 0.5 M סוכרוז) בצלחת פטרי 2 דקות לפני סוף הספירה לאחור.
- לעצור את ההקלטה כאשר הספירה 10 דקות מסתיימת ולהעביר במהירות של הבלסטוציסט ויטריפיקציה פתרון עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
- Pipette בעדינות את הבלסטוציסט לפחות 1 x בתוך הפתרון ויטריפיקציה.
- השתמש ויטריפיקציה קש עבור טעינה של הבלסטוציסט. טען, חפתי ו טיבלו את ויטריפיקציה קש חנקן נוזלי (LN) בתוך 80 s, שלא יעלה על 110 s לאחר החשיפה הראשונית אל הפתרון ויטריפיקציה.
7. עריכת וידאו של הבלסטוציסט שהוקלט במהלך שלב Equilibration
- ייבוא קובץ וידאו מוקלט לתוך תוכנת עריכת וידאו.
- הזז את המחוון ציר הזמן הערה ס' 20 מספר מסגרת בשלב זה.
הערה: מספר זה ישמש כדי להשמיד מסגרות וידאו מיותרים. רק מסגרות כל 20 s ישמש. - לחץ על הכרטיסיה וידאו , אז במסגרת שיעור... תחת מסגרת שיעור ההמרה, בדוק את השדה Decimate על-ידי , הזן את מספר מסגרת כאמור. לאשר על ידי לחיצה על אישור. לחץ על קובץ ייצוא ← ← רצף תמונות.
- בחרו JPEG כמו תבנית הפלט, להגדיר את הספריה שעליו להכיל את רצף תמונות שנשמרו, ולחץ על אישור.
הערה: פעולה זו תיצור ספריה עם עד 30 תמונות של הבלסטוציסט מוקלטות ברצף בשלב equilibration של ויטריפיקציה.
8. מדידות שטח חתך הרוחב של הבלסטוציסט מ תמונות שנוצרו במהלך שלב Equilibration
- פתח את תוכנת ניתוח וידאו. לחץ על הכרטיסיה החלון ובחר את ציר הזמן.
- בתוך חלונית ציר הזמן, לחץ על הסימן רצועת הסרט ובחרו ' הוסף מדיה. כדי להוסיף תמונה של הבלסטוציסט לפני השלב equilibration של ויטריפיקציה — לפני ההתערבות לייזר, אם היה מישהו.
הערה: תמונה זו יציג את הבלסטוציסט במצבו המורחב ביותר, אזור חתך הרוחב שלו ישמש כנקודת התייחסות. - הוסף את רצף תמונות הבלסטוציסט המקביל שנוצר קודם לכן עם תוכנה לעריכת וידאו (של שלב equilibration של ויטריפיקציה).
- עבור אל התמונה ← ניתוח ← בחר נקודות נתונים ← מותאמת אישית כדי לפתוח את החלון בחר נקודות נתונים .
- בטלו את הסימון לכל נקודות הנתונים, ולאחר מכן בחר רק באזור, ואשר על-ידי לחיצה על אישור.
- הזז את המחוון ציר הזמן בחלון ציר הזמן לתמונה הראשונה.
- לחץ על הכרטיסיה חלון , בחרו ' כלים'.
הערה: פעולה זו תפעיל את החלונית ' כלים ' בצד שמאל. - בחר את הכלי בחירה מהירה.
- מקם את הסמן כלי בתוך הבלסטוציסט לגעת בקצה הבלסטוציסט. חלוקה לרמות של הבלסטוציסט על-ידי הצבת הסמן כלי על הקצה החיצוני של הבלסטוציסט, לחיצה, החזקת לחצן העכבר השמאלי, וגרירת הסמן הכלי לאורך הקצה החיצוני של הבלסטוציסט עד שטח חתך הרוחב של הבלסטוציסט כל נבחרה.
הערה: Zona pellucida אינו חלק המדידה, אז זה בטח לא נכלל (איור 5). - חלון ציר הזמן, לחץ על יומן המדידות ולחץ על הלחצן ' הקלט מדידות '.
הערה: זה ירשום את האזור הנבחר. - לחזור בחזרה ציר הזמן, לחץ לחיצה ימנית על התמונה, ובחרו ' בטל בחירה '.
- הזז את המחוון ציר הזמן לתמונה הבאה ולחץ על המשבצת המתאימה מתחתיו.
- חלוקה לרמות של הבלסטוציסט בתמונה החדשה בעזרת הכלי בחירה מהירה. חזור על המדידה.
- חזור על הליך זה (שלבים 8.9-8.13) התמונה על-ידי תמונה עד אזורים חתך הרוחב של כל התמונות הם מדדו ורשמו.
- בסופו של דבר, לכי ביומן המדידות, בחר את כל המידות תחת המשתנה אזור אותם ולייצא אותם בתוך קובץ. txt.
הערה: היחידות של האזור חתך הן פיקסלים מרובעים.
9. עריכה של קובץ הנתונים עם אזורים חתך הרוחב של הבלסטוציסט מוקלטות, מתמונות שנוצרו במהלך שלב Equilibration
- להעביר את המידע של אזורים חתך הרוחב של הבלסטוציסט מוקלטות מתוך הקובץ. txt עורך גיליון אלקטרוני.
- השתמש שטח חתך הרוחב לערך הראשון כערך אסמכתא 1 ו אקספרס (שינוי צורה) כל הערכים האחרים, להיות חלק של זה הפניה ערך.
- ליצור Area_r משתנה חדש ולהדביק הערכים אזור המומרים (למעט הערך הפניה) מתחתיו.
- ליד המשתנה Area_r, צור משתנה זמן ולהוסיף ערך הזמן הראשון.
הערה: ערך הזמן הראשון מייצג את הזמן אשר חלף מהרגע שהבלסטוציסט נחשף אל הפתרון equilibration תחילתה של הקלטה תחת מיקרוסקופ מצויד במצלמה. - לחשב את הערך הבא כל הזמן ברציפות על-ידי הוספת 20 s לערך הזמן הקודם.
הערה: זהו מרווח הזמן המשמש-הפחתה מיותרים מסגרות וידאו שנוצרו במהלך ההקלטה.
10. התחממות של הבלסטוציסט
- להכין מדיה התחממות כדור הארץ.
- יום לפני התחממות של הבלסטוציסט, לוותר על גילוח ורחיצה כירורגית 150-µL 3, טיפות שחזור בינוני בקערה 4-. טוב. גם, גילוח ורחיצה כירורגית לוותר שחזור במדיום צלחת 9-ובכן microdroplet תוכנן במיוחד עבור זמן לשגות מיקרוסקופ והקלטה. מכסה המדיום שחזור בשמן פרפין, preincubate זה ב 37 ° C עם 6% CO2 ו- 5% או2.
הערה: שחזור בינוני הוא מדיום טיפוח בשלב הבלסטוציסט העוברים עם מוסף אנושי אלבומין (HSA). HSA במדיום שחזור צריך להיות 12 מ"ג/מ"ל. כדי למלא את החורים המנה 9-ובכן, השימוש של פיפטה עבור oocyte חסיפה כדי למנוע היצירה של בועות אוויר, ולאחר מכן כיסוי האזור microdroplet עם 30 µL של שחזור בינוני. - ביום של התחממות של הבלסטוציסט, גילוח ורחיצה כירורגית לוותר על µL 500 של מפשיר פתרון (TS) בטוב יחיד של מנה 4-ובכן, לאפשר את לחמם עד 37 ° C באינקובטור בלי CO2.
- בטמפרטורת החדר, גילוח ורחיצה כירורגית לוותר על טיפה אחת 50-µL של דילול פתרון (DS), ו2-טיפות 50-µL לרחוץ את הפתרון (WS) בצלחת פטרי סטריליות. מכסים את הטיפות DS ואת WS1 WS2 בשמן פרפין.
הערה: במקום צלחת פטרי, מנה 4-טוב יכול לשמש גם.
- יום לפני התחממות של הבלסטוציסט, לוותר על גילוח ורחיצה כירורגית 150-µL 3, טיפות שחזור בינוני בקערה 4-. טוב. גם, גילוח ורחיצה כירורגית לוותר שחזור במדיום צלחת 9-ובכן microdroplet תוכנן במיוחד עבור זמן לשגות מיקרוסקופ והקלטה. מכסה המדיום שחזור בשמן פרפין, preincubate זה ב 37 ° C עם 6% CO2 ו- 5% או2.
- חממו את הבלסטוציסט.
- לזהות את הקש HSV עם הבלסטוציסט vitrified יוסר תוך אחסון ולהעביר במהירות את הקש למאגר LN מלא ניידים לקראת ההליך התחממות כדור הארץ.
- . תרים את הקש עם מלקחיים, בדיוק מספיק לחשוף את המוט טיפול בצבע. השימוש חשפנית תיל התאמת עצמית לחתוך את הקש בשיאה של המוט טיפול בצבע.
- . תפוס את המוט טיפול לחלץ אותו מהקש עם תנועה מהירה, אך מבוקר, ואתה מיד טיבלו המרית מעוקל של המוט טיפול 37 ° C TS.
- מערבולת בעדינות את המוט טיפול כדי לנתק את הבלסטוציסט ולהשאיר את זה על סך של 1 דקות ב- TS.
- בטמפרטורת החדר, להעביר את הבלסטוציסט ברציפות DS, WS1 ו- WS2 במשך 4 דקות כל מדיום.
- לאחר הניתוח התחממות כדור הארץ, להעביר את הבלסטוציסט מנה 4-ובכן שחזור בינונית, לשטוף אותו בתוך כל שלוש טיפות על ידי בעדינות pipetting זה.
הערה: הכביסה מתבצע בכ-1 דקות. - העברה של הבלסטוציסט המנה 9-טוב בצילום מואץ עם שחזור בינוני. מניחים את המנה 9-ובכן תחת מצלמה זמן לשגות בתוך אינקובטור (ב 37 ° C עם 6% CO2 ו- 5% או2).
הערה: הליך התחממות כדור הארץ שלושה, אשר ממשיכה עם הצבת המנה 9-ובכן תחת מצלמה זמן לשגות באינקובטור, נמשך כ- 17 דקות.
11. זמן לשגות הקלטה של הבלסטוציסט Re-הרחבת במהלך ההתאוששות שלאחר התחממות כדור הארץ
- הפעל תוכנת הקלטה זמן לשגות.
- בחרו מצלמה הקלטה.
- לחץ על לחצן לחיות במצב .
- מקם את מצביע העכבר על התמונה, השתמש בלחצן הגלילה כדי להגדיל אותה. לחץ לחיצה ארוכה על לחצן העכבר השמאלי ו הזז את הסמן למקום הבאר עם הבלסטוציסט במרכז המסך.
- תחת התמקדות, השתמש בחצים למעלה-למטה ירוק למקד את המטוס הקלטה של הבלסטוציסט. תחת עוצמת האור, להגדיר את עוצמת האור.
- לחץ על הלחצן parameters מיקרוסקופ כדי לקבוע את זמן החשיפה גמא.
- הקש על סגור את מצב בשידור חי.
- לחץ על לחצן הפעלת הפרוייקט , להזין את נתוני הפרוייקט, בחר בסוג מאכל תרבות (3 x 3 או 4 x 4) ולהוריד את כל העמדות חוץ שיירשמו.
- להגדיר את התזמון הלכידה כדי לצלם תמונה כל 5 דקות.
- להתחיל להקליט על ידי לחיצה על הלחצן ' אשר '. שיא לפחות 150 דקות.
- לעצור את ההקלטה על-ידי לחיצה על הלחצן לעצור את הפרויקט .
הערה: ראה תוצאות נציג ההקלטה של שלם (איור 3), של הבלסטוציסט מכווצת (איור 4) במהלך תקופת ההחלמה שלאחר התחממות כדור הארץ.
12. עריכת וידאו של הבלסטוציסט שהוקלט במהלך Re-הרחבה פוסט-חומה
- עבור אל התיקיה פרויקט ואתר תמונות מוקלטות נמצאים בערך 80 KB גודל.
- ליצור תיקיה אחרת ולהעביר את התמונות האלה לתוך זה. שנה את התמונות לפי הזמן נוצר. לייבא אותם לתוך וידאו עריכה תוכנה כמו רצף תמונות.
- עבור אל הכרטיסיה וידאו ← מסנן ← הוספה , בחר מסנן Null המרה .
- לחץ על הלחצן חתוך בצד ימין, חיתוך התמונה, עוזב גלוי רק את השדה עם הבלסטוציסט המוקלט. לאשר אישור , שוב עם אישור.
- לחץ על קובץ ייצוא ← ← רצף תמונות. בחרו JPEG כמו תבנית הפלט, להגדיר את הספריה שעליו להכיל את רצף תמונות שנשמרו, ולחץ על אישור.
הערה: פעולה זו תיצור תמונות (חתוכה) שגודלה השתנה מוכן למדידות נוספות בתוכנה ניתוח וידאו.
13. ההגדרה של מידה בניתוח וידאו תוכנה לתמונות שנוצרו באמצעות תוכנת הצריבה בצילום מואץ
- להפעיל את מנתח של תוכנת הצריבה זמן לשגות.
- פתח את הפרוייקט עם הבלסטוציסט המוקלט.
- לחץ על כפתור ניתוח על המגרש עם הבלסטוציסט המוקלט.
הערה: נתח חלון חדש יפתח. לחץ על לחצן מדידה להצגת הכלי מדידה. - השתמש בכלי מדידה למדוד את הרוחב של כל התמונה.
- לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולשמור אותו. מאפייני, בדוק הרוחב של התמונה בפיקסלים.
- לחלק רוחב של התמונה בפועל רוחב בפיקסלים.
הערה: זו מחשבת את האורך הממשי של פיקסל בודד בתמונה זו. - להפעיל את התוכנה ניתוח וידאו.
- לחץ על הכרטיסיה החלון ובחר את ציר הזמן.
- בתוך חלונית ציר הזמן, לחץ על הסימן רצועת הסרט ובחרו ' הוסף מדיה. כדי להוסיף את רצף תמונות הבלסטוציסט מחדש הרחבת פוסט-חם.
- לחץ על התמונה ← ניתוח ← ← קבע קנה מידה מותאם אישית כדי לפתוח את החלון קנה מידה. עבור אורך פיקסל, הזן 1; עבור אורך לוגי, הזן את האורך הממשי בעבר מחושב של פיקסל (שלב 13.6); עבור יחידות לוגיות, הזן מיקרומטר. להציל הקביעה המוגדרת מראש.
14. מדידות שטח חתך הרוחב של הבלסטוציסט מתמונות שנוצרו במהלך פוסט-חמה Re-הרחבה
- ברגע קנה המידה הוא להגדיר את רצף תמונות מיובאות, למדוד אזורים חתך הרוחב של הבלסטוציסט באותו האופן כפי שמתואר בשלב 8, כאשר ההבדל היחיד להיות כי האזורים חתך הרוחב נמדד במדידות האלה יש יחידות מיקרומטר2 .
15. עריכה של קובץ הנתונים עם אזורים חתך הרוחב של הבלסטוציסט מוקלטות, מתמונות שנוצרו במהלך פוסט-חמה Re-הרחבה
- להעביר את המידע של אזורים חתך הרוחב של הבלסטוציסט מוקלטות מתוך הקובץ. txt עורך גיליון אלקטרוני.
- צור משתנה הזמן ליד המשתנה אזור ולהוסיף ערך הזמן הראשון.
הערה: במקרה זה, הערך הראשון זמן מוגדר 10 דקות, וזו תחילתה של ההקלטה זמן לשגות. כל ערך זמן רצופים הבא מחושבת על-ידי הוספת 5 דקות לערך הזמן הקודם. חמש דקות הוא מרווח הזמן המשמש בין שתי הקלטות זמן לשגות רצופים.
16. יצירה של תרשים קו
- יבא את קובץ נתוני גיליון אלקטרוני בתוכנה ניתוח סטטיסטי ליצירת מגרש זמן של שינויים שטח חתך הרוחב של הבלסטוציסט בזמן במהלך שלב equilibration של ויטריפיקציה או re-הרחבה פוסט-התחממות כדור הארץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהפגנה, הראנו הבלסטוציסט morphodynamics previtrification אחד בלבד, שלב ההתחממות פוסט אחד. הבדל בהיקף של הבלסטוציסט בסוף השלב equilibration, בתחילת מחלים במדיום תרבות הראה את עוצמת ההתכווצות העובר, אשר, למעשה, האינטנסיביות של העובר שימור נגד התגבשות קרח.
כמו זה ניתן להבחין בין איור 1 וידאו 1, הבלסטוציסט שלם לא קרסו לחלוטין בפתרון equilibration. Blastocoel באופן חלקי בלבד, אך תוך 10 דקות, הגיע לאט re-הרחבה בגודל של 70%. בניגוד לזה, הבלסטוציסט המצומצם באופן מלאכותי מרוקנת לחלוטין את blastocoel מיד לאחר טיפול לייזר, אך בפתרון equilibration, הנפח שלה לא השתנה כל עוד (איור 2, סרטון 2). המצגת של blastocoel re-הרחבת אמצעי השחזור (איור 3 ו איור 4) עם microphotographs ועם קו דיאגרמות מראה דפוסים שונים של צמיחה blastocoel. תצוגה של מידה אחת של אזור חתך הרוחב של הבלסטוציסט מוצג באיור5.
ויטריפיקציה בינוני עם ריכוז גבוה יותר של cryoprotectants, blastocysts ללא פגע באופן אינטנסיבי התכווץ שוב, בזמן אמצעי האחסון של הבלסטוציסט מכווצת נשאר כמעט ללא שינוי. ממצגת גרפי, באמצעות פרוטוקול המובאים כאן, זה ברור הבלסטוציסט שלם עובר הפחתה stepwise את blastocoel (איור 6), פעם אחת פתרון equilibration, פעם במדיום ויטריפיקציה, ואילו קרס הבלסטוציסט מגיעות לשלב הגמדי בתחילת ההתערבות עם לייזר (איור 7). זה מציב את השאלה אם 10 דקות של equilibration שלב הכרחי באמת blastocysts התמוטט, או תקופה זו יכולה להתקצר.
המצגת של blastocoel re-הרחבה יכולה להיות לינארית או מופרע עם התכווצויות או נקטין מספר (איור 8).
איור 1: זמן לשגות microphotography על השינויים של הבלסטוציסט ללא פגע במהלך החשיפה לפתרון equilibration. תמונות יחיד נרשמו בכל 20 שניות. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זמן לשגות microphotography על השינויים של הבלסטוציסט באופן מלאכותי התמוטט במהלך החשיפה לפתרון equilibration. תמונות יחיד נרשמו בכל 20 שניות. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: זמן לשגות microphotography על השינויים של הבלסטוציסט שלם במהלך התחממות כדור-הארץ recoverypost. תמונות יחיד נרשמו כל 5 דקות. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זמן לשגות microphotography על השינויים של הבלסטוציסט התמוטט במהלך התחממות כדור-הארץ recoverypost. תמונות יחיד נרשמו כל 5 דקות. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: התצוגה של מדידה אחת של אזור חתך הרוחב הבלסטוציסט. הבלסטוציסט מסומן בעיגול בזהירות בעזרת הכלי בחירה המתאים בתוכנת ניתוח וידאו. Pellucida zona לא נכללים תמיד מן המדידה. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: ייצוג של השינויים באזור חתך הרוחב של הבלסטוציסט שלם. אלה מראות על הייצוג של שינויים באזור חתך הרוחב הבלסטוציסט שלם במהלך חשיפה equilibration פתרון (A) ויטריפיקציה ו- (B) במהלך ההתאוששות שלאחר ההתחממות. היחידות של האזור חתך הן יחסיות שטח חתך הרוחב של הבלסטוציסט הראשוני לפני ויטריפיקציה. קו מקווקו חיבור לוחות A ו- B הוא דמיוני, המייצג את השינויים במהלך ויטריפיקציה, קירור-196 מעלות, ואני מהרהרת 37 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: ייצוג של השינויים באזור חתך הרוחב הבלסטוציסט התמוטט. הפאנלים להציג הייצוג של שינויים באזור חתך הרוחב של (A) הבלסטוציסט התמוטט במהלך החשיפה לפתרון equilibration (B)-ויטריפיקציה ו- (ג) במהלך ההתאוששות שלאחר ההתחממות. היחידות של האזור חתך הן יחסיות שטח חתך הרוחב של הבלסטוציסט הראשוני לפני קריסה ויטריפיקציה. הקו המקווקו-פאנל A הוא דמיוני ומייצג את נקודת ההתחלה והסיום במהלך ההתמוטטות הבלסטוציסט. הקו המקווקו דמיוני בין לוחות B ו- C, מייצג גם את השינויים במהלך ויטריפיקציה, קירור-196 מעלות, ואני מהרהרת 37 מעלות צלזיוס. רק את הקווים מוצק פאנלים B ו- C הן התוצאה של מדידות בפועל של האזור חתך במהלך equilibration ואת תהליך ההחלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: מצגת גרפית של דפוסים שונים של הבלסטוציסט התאוששות לאחר מתחמם. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
1 וידאו: צילומי הווידאו של השינויים של הבלסטוציסט ללא פגע במהלך החשיפה לפתרון equilibration. הוידאו מייצג את השינויים, אשר כמעט 10 דקות בזמן אמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
2 וידאו: צילומי הווידאו של השינויים של הבלסטוציסט התמוטט במהלך החשיפה לפתרון equilibration. הוידאו מייצג את השינויים, אשר כמעט 10 דקות בזמן אמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול עבור התצפית של הבלסטוציסט morphodynamics במהלך ואחרי הקפאה קריוגנית יכול גם להתבצע באמצעות כלים דומים וכלי תוכנה של יצרנים אחרים. מערכות זמן לשגות מותאם אמבריולוגיה מאפשרות ניטור רציף של התפתחות העובר. מטרת עבודה זו היתה להציג כימות של הבלסטוציסט התנהגות במהלך הכנת blastocysts עבור ויטריפיקציה ואחרי התחממות שלהם. זה נעשה על ידי המדד האובייקטיבי של שינויים המורפולוגיה בציר. שהושג תוצאות מדידות אלה יכול להיות מבחינה מתמטית ניתח, לעומת תוצאות אחרות. בין הפרמטרים יכולה להיות מלווה את הפרוטוקול המתואר שינויים בגודל של הבלסטוציסט, הפנימית שלה המוני תאי, את blastocoel או את pellucida zona בתוך פרק זמן מסוים. ניתן להציג את הגודל כמו שטח חתך הרוחב הבלסטוציסט הגדול, את היקף הבלסטוציסט או קוטר, ואחרי, חישוב, אפילו בתור הנפח שלה.
במחקרים קודמים באמצעות מערכות זמן לשגות, נעשו מדידות מהירות התפשטות blastocoel רק על העוברים טריים11. ב- blastocysts vitrified/להתחמם, רק גדלים blastocysts' נמדדו מיד לאחר התחממות ולפני העברת העובר, או ניתחנו את תקופת הזמן שבה חימם blastocysts מחדש התרחב zona pellucida9,10 . דינמיקה מפורט יותר של re-הרחבת הבלסטוציסט נותחו רק ב שלנו המחקר הקודם8. במחקר זה, פרוטוקול morphometric שימש כבר לאתר את המהירות ואת התבנית של הבלסטוציסט re-הרחבות לאחר התחממות כדור הארץ. למרות אלה סמנים ביולוגיים צמיחה הבלסטוציסט הראו שאין ערך ניבוי גבוה להשתלה, הם יכולים לשמש עבור ההשוואה של הבלסטוציסט שחזור פוטנציאלי לאחר ויטריפיקציה ומחמם עם מדיה שונים הקפאה קריוגנית ופרוטוקולים . כלומר, הצירים רבתי של הבלסטוציסט במהלך blastocoel re-הרחבה להציע את החולשה של השכבה trophectodermal שיכולים להיגרם במהלך הקפאה קריוגנית, ואת יכולתו לשאת את הלחץ שנעשו על ידי blastocoel מלאות נוזל.
הפרוטוקול המתואר morphometric יכול לספק ניתוחים רבים נוספים השוואתי בהתנהגות הבלסטוציסט, לא רק לאחר הקפאה קריוגנית, על ידי מדידת את המהירות ואת האינטנסיביות של שינויי נפח, מספר ההתכווצויות blastocoel חלקית או סה הבלסטוציסט מתמוטטת, הזמן הכולל blastocoel re-הרחבה, או זמן הבקיעה. יתר על כן, זה יכול לשמש גם במהלך שלבי previtrification לקביעת העיתוי האופטימלי ביותר של חשיפה הבלסטוציסט ריכוזים שונים של cryoprotectants, כפי שהוצגה בתוצאות. . Vanderzwalmen et al. הראו oocytes עכברים שויטריפיקציה הזה גם יכול להיות מוצלח אם תאיים לחץ אוסמוטי לא מגיע שיווי עם פתרון חיצוני cryoprotectant12. שלב בעייתי רק עבור ההקלטה של blastocysts במהלך שימור הוא התקופה בפתרון ויטריפיקציה עקב זמן מוגבל; העובר צריך להיות חשוף ריכוז גבוה יותר של cryoprotectants ארוזים בתוך הקש ב פחות מ-90 שניות. עבור מדידות אלה, זה להיות מומלץ להשתמש רק blastocysts כי הם תרמו למחקר. למרות זאת, blastocysts קלינית זמין ניתן מוקלטות, נמדד שוב מיד לאחר התחממות, במטרה לבחון כיצד הם מתנהגים דילול ושטיפת פתרונות. מיד לאחר העברה הבלסטוציסט מהפתרון כביסה למדיום השחזור, blastocysts נוטים לצוף מלמטה. זה יכול לייצג קושי בשמירה על העובר באותו מישור מוקד במהלך ההקלטה. כדי לפתור בעיה זו, מומלץ להכין מאכל עם טיפות שעברו שיטוח של המדיום. בעיה דומה נצפתה על ידי. Vanderzwalmen et al. 12.
במחקר נוסף, זה יהיה שימושי לחקור יופחת משך חשיפה של blastocysts באופן מלאכותי התמוטט cryoprotectants, וכתוצאה מכך צמצום השפעת חומרים אלה רעילים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו היא חלק מפרויקט מחקר תוכנית P3-0327 ומחקר J3-7177, נוסד על ידי קרן המחקר הסלובני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
