Summary
Aquí presentamos un protocolo de Time-lapse morfométricos para seguir la intensidad de la contracción de blastocisto y re-expansión durante intervenciones previtrification y la recuperación post calentamiento. La aplicación del protocolo en vitro fecundación laboratorios con microscopios de lapso de tiempo es posible y se recomienda en el desarrollo de un método de vitrificación de blastocistos óptima.
Abstract
Este artículo describe el método no invasivo de blastocisto Morfometría basada en time-lapse microfotografía para el control preciso del volumen de un blastocisto cambiando durante las fases individuales antes y después de la vitrificación. El método puede ser útil en la búsqueda del momento más óptimo de la exposición de blastocisto a distintas concentraciones de crioprotectores, observando la contracción de blastocisto y re-expansión en diferentes pre- y post vitrificación fases. Con esta metodología, se puede optimizar el protocolo de vitrificación de blastocistos. Para una mejor demostración de la utilidad de este método morfométrico, se comparan dos protocolos de preparación de diferentes blastocisto para vitrificación; uno con el uso de un artificial blastocoel colapso y otro sin esta intervención antes de vitrificación. Los cambios en el volumen de blastocistos son seguidos por microfotografía Time-lapse y medidas por herramientas de software de edición de fotos. Las mediciones se toman cada 20 segundos en las fases previtrification y cada 5 minutos en el período post calentamiento. Los cambios de las dimensiones del blastocisto por unidad de tiempo se presentan gráficamente en diagramas unifilares. Los resultados muestran una fase de previtrification de largo equilibrado en el que el blastocisto intacto primero se contrae y luego rellena lentamente el blastocoel, entrar en vitrificación con un blastocoel llena de líquido. El blastocisto artificial derrumbado permanece en su etapa contraído a través de la fase de equilibrar todo. Durante la fase de vitrificación, también no cambia su volumen. Puesto que la morfometría de blastocisto muestra un volumen constante de los blastocistos artificialmente colapsados durante el paso de previtrification, parece que esta etapa podría ser más corta. El protocolo descrito proporciona muchos parámetros adicionales comparativos de comportamiento del blastocisto durante y después de la criopreservación sobre la base de la velocidad y la intensidad de los cambios de volumen, el número de contracciones del blastocoel parcial o total de blastocistos se derrumba y el tiempo para una re-expansión del blastocoel total o el tiempo de incubación.
Introduction
Criopreservación de embriones preimplantación humanos en vitro fecundación del programa de (FIV) es actualmente una práctica habitual en la mayoría de los laboratorios FIV. El embrión lento congelación método comenzó a utilizarse clínicamente en 1985, con la introducción de crioprotectores específicos y congeladores controlados por computadora, que permitió el enfriamiento controlado de embriones hasta-7 ° C, cuando la nucleación de hielo (siembra) fue inducida en el alrededor de crioprotectores medio1. Por enfriamiento continuo, crecen los cristales de hielo, causando el hyperosmolality de la fracción líquida restante y, en consecuencia, la deshidratación y contracción de las células embrionarias. A-30 ° C o -80 ° C, los embriones se le hundió en el nitrógeno líquido para un almacenaje más largo. Sólo por cryomicroscopes especialmente adaptados, que ayudó a mejorar los protocolos de criopreservación2se pudo observar lo que sucedía con los embriones u ovocitos durante el enfriamiento. La congelación de blastocistos, un volumen más alto y más etapa embrionaria contiene líquido, dio los resultados clínicos menos prometedoras en aquellos días3.
Los avances en la criopreservación del blastocisto era la introducción del método de vitrificación, en el que la deshidratación de las células tuvo lugar antes de enfriamiento mediante el uso de altas concentraciones de crioprotectores4. La eliminación del fluido del blastocoel antes de vitrificación se logra también haciendo una apertura mecánica entre dos de las células trophectoderm5. Aunque la tasa de supervivencia inmediata blastocisto después de la vitrificación y el calentamiento es por encima de 90% y el siguiente resultado clínico la transferencia de blastocitos vitrificados/calentados en la cavidad uterina es casi comparable a los resultados después de la transferencia de frescos embriones, este método de criopreservación no ha sido aún estandarizada6,7. Protocolos de vitrificación varían según el tipo y la concentración de crioprotectores, (b) el número de pasos de previtrification, (c) la duración de cada paso, (d) el uso de un artificial blastocoel que se derrumban antes de vitrificación o no, (e). colapso de métodos, (f) la expansión del blastocisto etapa y (g) la temperatura de equilibrio/vitrificación en que los embriones deben ser vitrificados8. Desde crioprotectores pueden ser tóxicos para las células, el tiempo de exposición de blastocisto a estas soluciones tiene que ser definidas. Sin embargo, algunos fabricantes de medios de criopreservación que protocolos muy flexibles.
El interés de los científicos generalmente se centra en el estudio de la capacidad de re-expansión del blastocisto con el objetivo de buscar nuevos biomarcadores con un mejor pronóstico de implantación6,9,10. Cómo blastocistos humanos deshidratan en distintas etapas de la adición de crioprotectores antes de vitrificación y que pasa con blastocistos después de la vitrificación y el calentamiento, cuando crioprotectores han de ser eliminados de las células, y cómo los blastocistos rehidratar y volver a expandir después de calentamiento, no bien descrito ni entendido. El desarrollo de una metodología para el objetivo y cuantificado seguimiento de comportamiento del blastocisto durante los pasos de criopreservación diferentes es, pues, razón de ser.
Con microscopios de Time-lapse de diversos fabricantes, ahora es posible monitorear el comportamiento del blastocisto en pre y post vitrificación fases. Mediante la inclusión de herramientas informáticas adicionales, también se pueden realizar mediciones de su tamaño (morfometría). Medición de la disminución o aumento de tamaño del embrión en un momento dado, es posible objetivar la evaluación de la morfodinámica de embriones durante la deshidratación y rehidratación.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité Nacional de ética médica en 19 de abril de 2016 (Nº 0120-204/2016 – 2).
1. instalación del sistema de grabación de microscopio
- Apague la placa calefactora del microscopio.
- Antes de cualquier tratamiento, tomar una instantánea de un blastocisto bajo un microscopio invertido equipado con cámara. Recuerde tener en cuenta el aumento que se registró el blastocisto.
2. selección y Prepreparation de blastocistos para vitrificación
- Seleccione solamente blastocistos día 5 o 6 día completamente ampliados para la criopreservación con al menos unos (ICM) masa celular interna de las células y cohesivo trophectoderm.
- Para blastocistos laser-tratado con una atelectasia blastocoel, tema un blastocisto a un pulso de láser corto (0,4 - 0,7 ms) con un diámetro de agujero desde 4.3 hasta 9,4 μm, dirigida tangencialmente en la zona pelúcida y en una Unión de dos células adyacentes trophectodermal. Permita que el blastocisto al colapso total o parcialmente durante 5 minutos.
- Para blastocistos sin tratar con un intacto blastocoel, no realizar ningún tratamiento especial antes de vitrificación.
Nota: Estos blastocistos se consideran intactas.
3. preparación de crioprotector y una placa de Petri para la fase de equilibrio
- Pipeta de pithe uso de denudación del ovocito (diámetro 135 μm) llenar asépticamente medios equilibrar (medio tamponado con HEPES M-199 7,5% DMSO, 7.5% glicol de etileno, 20% DSS) en los orificios de la zona del microdroplet de un plato de Petri de 9 bien diseñado especialmente para grabación y Time-lapse microscopia.
Nota: Denudación de ovocitos es un proceso de eliminación de células del cúmulo que rodean al ovocito. El uso de una pipeta de denudación de ovocitos ayudarán a evitar la creación de burbujas de aire. - Sobreponer el área microdroplet con 30 μl de medio equilibrado.
4. transferencia de blastocisto en la solución de equilibrado
- Sumerja un blastocisto intacto o tratados con láser en el medio de equilibrar a la parte inferior de la zona del microdroplet del microdroplet plato por 10 min a temperatura ambiente (fase de equilibrio).
- Iniciar una cuenta atrás de 10 minutos cuando el blastocisto se transfiere al medio equilibrado.
5. grabación del blastocisto en la fase de equilibrio
- Transferir el plato microdroplet con el blastocisto a un microscopio equipado con cámara. Utilice el mismo aumento previamente para tomar una instantánea del mismo blastocisto. Posición del microdroplet plato para que el blastocisto se coloca aproximadamente en el centro de la grabación.
- Iniciar la grabación con el microscopio, software de grabación. Tenga en cuenta el tiempo de cuenta regresiva en la que se inicia la grabación.
Nota: Ver resultados representativos de las grabaciones de un intacto (figura 1, Video 1) y un blastocisto colapsado (figura 2, Video 2) durante la exposición de 10 minutos a una solución de equilibrio.
6. vitrificación del blastocisto
- Distribuir asépticamente una gota de 50 μl de solución de vitrificación (medio tamponado con HEPES M-199 con 15% DMSO etilenglicol 15%, 20% DSS, sacarosa 0.5m) en una placa Petri 2 minutos antes de que termine la cuenta regresiva.
- Detener la grabación cuando la cuenta regresiva de 10 minutos termina y transferir rápidamente el blastocisto a la solución de vitrificación para 30 s a temperatura ambiente.
- Pipetee suavemente el blastocisto al menos 1 x dentro de la solución de vitrificación.
- Use una vitrificación paja para cargar el blastocisto. Cargar, sello y hundir la vitrificación paja en nitrógeno líquido (LN) en los 80 s, no exceda de 110 s después de la exposición inicial a la solución de vitrificación.
7. video edición del blastocisto registrado durante la fase de equilibrio
- Importar un archivo de vídeo grabado en el software de edición de vídeo.
- Mueva el control deslizante de línea de tiempo a 20 s. Nota el número de fotograma en este momento.
Nota: Este número se utilizará para diezmar fotogramas de video innecesarios. Sólo Marcos cada 20 s se utilizará. - Haga clic en la ficha vídeo , luego fotogramas.... Con conversión de frecuencia de cuadro, compruebe el campo de diezmar por e introduzca el número de marco previamente conocido. Confirmar haciendo clic en Aceptar. Haga clic en archivo → exportar → secuencia de imágenes.
- Seleccione JPEG como formato de salida, configurar el directorio para sostener la secuencia guardada de imágenes y haga clic en Aceptar.
Nota: Esto creará un directorio con hasta 30 imágenes del blastocisto grabado en secuencia durante la fase de equilibrio de la vitrificación.
8. medidas de superficie transversal del blastocisto de imágenes creadas durante la fase de equilibrio
- Abra el software de análisis de vídeo. Haga clic en la pestaña de la ventana y seleccione línea de tiempo.
- En el panel Línea de tiempo, haga clic en el signo de la tira de película y elija Agregar medios de comunicación... para agregar una imagen del blastocisto antes de la fase de equilibrio de la vitrificación y antes de la intervención láser, si hubo alguno.
Nota: Esta imagen muestra el blastocisto en su estado más expandido y su área transversal servirá como una referencia. - Agregue la secuencia de imágenes del blastocisto correspondiente generado previamente con software de edición de video (de la fase de equilibrio de la vitrificación).
- Ir a imagen → análisis → Seleccionar puntos de datos → Custom para abrir la ventana de Seleccionar puntos de datos .
- Deseleccionar todos los puntos de datos, luego seleccionar sólo el área y confirme haciendo clic en Aceptar.
- Mueva el control deslizante de la línea de tiempo en la ventana de línea de tiempo a la primera imagen.
- Haga clic en la pestaña ventana y escoge herramientas.
Nota: Esto activará el panel de herramientas en el lado izquierdo. - Elija la herramienta Selección rápida.
- Colocar el marcador de la herramienta dentro del blastocisto para tocar el borde del blastocisto. El blastocisto del esquema colocando el marcador de la herramienta en el borde exterior del blastocisto, haciendo clic y manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón y arrastre el marcador de la herramienta a lo largo del borde exterior del blastocisto hasta el área transversal del blastocisto todo seleccionado.
Nota: Zona pelúcida no es una parte de la medición, por lo que debe ser excluido (figura 5). - En la ventana línea de tiempo, haga clic en el Registro de medición y pulse el botón de Registro de mediciones .
Nota: Esto grabará el área seleccionada. - Volver a la línea de tiempo, haga clic en la imagen y elija deseleccionar.
- Mueva el control deslizante de la línea de tiempo a la siguiente imagen y haz clic en la ficha correspondiente debajo de ella.
- Esquema del blastocisto en la nueva imagen con la herramienta de selección rápida. Repita la medición.
- Repita este procedimiento (pasos 8,9-8.13) imagen por imagen hasta áreas de sección transversal de todas las imágenes son medidas y registradas.
- Al final, ir al registro de las mediciones, seleccionar todas las medidas en la variable de la zona y exportarlos en un archivo .txt.
Nota: Las unidades de la superficie transversal son píxeles cuadrados.
9. editar el archivo de datos con áreas transversales de blastocisto grabados de imágenes creada durante la fase de equilibrio
- Transferir los datos de áreas transversales de blastocisto grabado desde el archivo txt en un editor de hoja de cálculo.
- Utilice el primer área de sección transversal valor como valor de referencia 1 y expreso (transform) todos los valores a ser una fracción de ese valor de referencia.
- Crear una nueva variable Area_r y pegar los valores de área de transcodificación (excepto el valor de referencia) debajo de él.
- Junto a la variable Area_r, cree una variable de tiempo y agregar valor en el primer tiempo.
Nota: El primer valor de tiempo representa el tiempo que pasó desde el momento en que el blastocisto fue expuesto a la solución de equilibrio para el inicio de la grabación con un microscopio equipado con cámara. - Calcular cada valor de tiempo consecutivos próximo mediante la adición de 20 s en el valor de tiempo anterior.
Nota: Este es el intervalo de tiempo utilizado en diezmar fotogramas de video innecesarios creados durante la grabación.
10. calentamiento del blastocisto
- Preparar los medios para el calentamiento.
- Un día antes de calentar el blastocisto, dispensar asépticamente tres gotas de 150 μL de medio de recuperación en un plato de 4 pozos. Además, dispensar asépticamente medio de recuperación en un plato de 9 pozos microdroplet diseñado especialmente para Time-lapse microscopía y grabación. El medio de recuperación de la cubierta con aceite de parafina y preincubate a 37 ° C con 6% CO2 y de 5% O2.
Nota: Medio de recuperación es un medio de cultivo de embriones en fase de blastocisto con agregado albúmina sérica humana (HSA). La HSA en el medio de recuperación debe ser de 12 mg/mL. Para llenar los agujeros en el plato de 9 pozos, utilice una pipeta de denudación de ovocitos para evitar la creación de burbujas de aire, luego superponer el área microdroplet con 30 μl de medio de recuperación. - En el día del calentamiento el blastocisto, asépticamente dispensar 500 μl de solución (TS) en un solo pozo de un plato de 4 pozos de descongelación y deje que se caliente a 37 ° C en una incubadora sin CO2.
- A temperatura ambiente, dispensar asépticamente una gota de 50 μl de solución de dilución (DS) y dos gotas de 50 μl de solución (WS) de lavado en una placa Petri estéril. Cubrir el DS y el WS1 WS2 gotas con aceite de parafina.
Nota: En lugar de un plato de Petri, un plato de 4 pozos puede también utilizarse.
- Un día antes de calentar el blastocisto, dispensar asépticamente tres gotas de 150 μL de medio de recuperación en un plato de 4 pozos. Además, dispensar asépticamente medio de recuperación en un plato de 9 pozos microdroplet diseñado especialmente para Time-lapse microscopía y grabación. El medio de recuperación de la cubierta con aceite de parafina y preincubate a 37 ° C con 6% CO2 y de 5% O2.
- Caliente el blastocisto.
- Identificar la paja de VHS con los blastocistos vitrificados a ser retiradas de los almacenes de LN y transferir rápidamente la paja a un depósito portátil lleno de LN en preparación para el procedimiento de calentamiento.
- Levantar la paja con pinzas, lo suficiente como para exponer la barra de manejo de color. Utilice un pelacables autoajustable para cortar la paja a la altura de la barra de manejo de color.
- Agarrar la barra de dirección y extraer de la paja con un movimiento rápido pero controlado y sumergirse inmediatamente la espátula curvada de la barra de dirección en los 37 ° C TS.
- Agitar suavemente la barra de dirección para separar el blastocisto y dejarlo para un total de 1 minuto en TS.
- A temperatura ambiente, transferir el blastocisto consecutivamente a DS y WS1 WS2 durante 4 minutos en cada medio.
- Después del procedimiento de calentamiento, el blastocisto de transferencia a un plato de 4 pozos con medio de recuperación y lavarlo en todos tres gotas transfiriendo suavemente.
Nota: El lavado se realiza en aproximadamente 1 minuto. - Transferencia de blastocisto al Time-lapse bien 9 plato con medio de recuperación. Coloque el plato 9-bien en una cámara de lapso de tiempo en una incubadora (a 37 ° C con 6% CO2 y de 5% O2).
Nota: Procedimiento de calentamiento Thre, que continúa con la colocación el plato 9-bien en una cámara de lapso de tiempo en una incubadora, dura aproximadamente 17 minutos.
11. Time-lapse grabación de la Re-expansión del blastocisto durante la recuperación post-calentamiento
- Ejecute el software de grabación Time-lapse.
- Elegir una cámara de grabación.
- Pulse el botón Live mode .
- Coloque el cursor del ratón sobre la imagen y use el botón de scroll para verla. Haga clic y mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón y mueva el cursor para colocar el pozo con el blastocisto en medio de la pantalla.
- En enfoque, utilice las flechas verdes de arriba-abajo para enfocar el plano de grabación del blastocisto. Intensidad de la luz, establecer la intensidad de la luz.
- Haga clic en el botón parámetros de microscopio para establecer el tiempo de exposición y Gamma.
- Pulse cerrar modo live.
- Pulse el botón iniciar proyecto de introducir los datos de proyecto, seleccione el tipo de plato de cultura (3 x 3 o 4 x 4) y desmarcar todas las posiciones excepto la que se registrará.
- Establezca la regulación de la captura para tomar una foto cada 5 minutos.
- Iniciar la grabación pulsando el botón aprobar . Registrar por lo menos 150 min.
- Detener la grabación presionando el botón de detener el proyecto .
Nota: Vea los resultados representativos de la grabación de un intacto (figura 3) y un blastocisto colapsado (figura 4) durante el período de recuperación post calentamiento.
12. video edición del blastocisto grabado durante el Re-expansión post calentamiento
- Ir a la carpeta del proyecto y ubicar imágenes grabadas que son aproximadamente 80 KB de tamaño.
- Crear otra carpeta y transferir estas imágenes en él. Cambiar el nombre de las imágenes de números según el tiempo creado. Importarlos en el software como una secuencia de imágenes de la edición de vídeo.
- Ir a la pestaña de vídeo → filtro → Add y seleccione filtro transformación nula .
- Haga clic en el botón de recortar a la derecha y recortar la imagen, dejando visible sólo en el campo con el blastocisto grabado. Confirme con OK y OKotra vez.
- Haga clic en archivo → exportar → secuencia de imágenes. Seleccione JPEG como formato de salida, configurar el directorio para sostener la secuencia guardada de imágenes y haga clic en Aceptar.
Nota: Esto crea imágenes (recortadas) tamaño preparados para más medidas en el software de análisis de vídeo.
13. configuración de una escala de medición de Software de vídeo análisis para las imágenes creadas con el Software de grabación Time-lapse
- Ejecute el analizador del software de grabación Time-lapse.
- Abre el proyecto con el blastocisto grabado.
- Haga clic en el botón analizar en el campo con el blastocisto grabado.
Nota: Se abrirá una nueva ventana de análisis. Haga clic en el botón de la medida para mostrar la herramienta de medición. - Utilice la herramienta de medición para medir la anchura de la imagen entera.
- Haga clic en la imagen y guardarla. En las propiedades, compruebe el ancho de la imagen en píxeles.
- Dividir la anchura real de la imagen con el ancho en píxeles.
Nota: Este calcula la longitud real de un solo pixel en esta imagen. - Ejecute el software de análisis de vídeo.
- Haga clic en la pestaña de la ventana y seleccione línea de tiempo.
- En el panel Línea de tiempo, haga clic en el signo de la tira de película y elija Agregar medios de comunicación... para agregar la secuencia de imágenes del blastocisto a expansión post caliente.
- Haga clic en imagen → análisis → Configurar escala de medida → Custom para abrir la ventana de escala de medida. Para la longitud de píxel, escriba 1; para la longitud lógica, introduzca la longitud real previamente calculada de un píxel (Paso 13,6); para unidades lógicas, escriba μm. guardar el preset.
14. medición del área transversal del blastocisto de imágenes creadas durante el cálido después de Re-expansión
- Una vez que la escala de medición es conjunto y la secuencia de imagen importados, medir áreas transversales de blastocisto al igual como se describe en el paso 8, con la única diferencia es que las áreas transversales medidas en estas mediciones tienen unidades en μm2 .
15. editar el archivo de datos con áreas transversales de blastocisto grabados de imágenes creadas durante el cálido después de Re-expansión
- Transferir los datos de áreas transversales de blastocisto grabado desde el archivo txt en un editor de hoja de cálculo.
- Cree una variable de tiempo junto a la variable de área y agregar valor en el primer tiempo.
Nota: en este caso, el primer valor de tiempo se establece a 0 minutos, que es el inicio de la grabación Time-lapse. Cada valor de tiempo consecutivos próximo se calcula agregando 5 minutos al valor anterior en el tiempo. Cinco minutos es el intervalo de tiempo utilizado entre dos consecutivas grabaciones time-lapse.
16. creación de un diagrama de línea
- Importar el archivo de datos de hoja de cálculo en el software de análisis estadístico para la creación de un diagrama de tiempo de los cambios de área de sección transversal del blastocisto durante la fase de equilibrio de la vitrificación o re-expansión posterior calentamiento.
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Representative Results
En una demostración, mostramos blastocisto morfodinámica en sólo una previtrification y una fase posterior calentamiento. Una diferencia de volumen de blastocisto en el final de la fase de equilibrio y el principio de recuperación en medio cultura demostrada la intensidad de la contracción del embrión, que es, de hecho, la intensidad de la preservación de embriones contra la cristalización de hielo.
Como se aprecia de la figura 1 y Video 1, el blastocisto intacto no colapsar completamente en la solución de equilibrio. El blastocoel contratado sólo parcialmente, pero en 10 minutos, poco a poco alcanzó el tamaño re-expansión del 70%. Contrario a esto, el blastocisto artificial colapsado completamente vacíos el blastocoel inmediatamente después del tratamiento láser, pero en la solución de equilibrado, su volumen no cambió ninguna más (figura 2, Video 2). La presentación del blastocoel re-expansión en medio de recuperación (figura 3 y figura 4) con microfotografías y línea diagramas muestra diferentes patrones de crecimiento de blastocoel. Una muestra de una sola medición de la superficie transversal del blastocisto se muestra en la figura 5.
En medio de la vitrificación con una mayor concentración de crioprotectores, blastocistos intactos intensivo redujo una vez más, mientras que volumen de blastocisto colapsado se mantuvo casi sin cambios. De una presentación gráfica, utilizando el protocolo presentado aquí, es evidente que el blastocisto intacto sufre una reducción gradual del blastocoel (figura 6), una vez en la solución de equilibrado y una vez en el medio de la vitrificación, mientras que el colapsó el blastocisto llegado encogido al principio de la intervención con láser (figura 7). Esto plantea la pregunta si 10 minutos de la fase de equilibrio es realmente necesario para blastocistos derrumbados, o si este período podría acortarse.
La presentación del blastocoel re-expansión puede ser lineal o interrumpido con varias contracciones más grandes o más pequeño (figura 8).
Figura 1: microfotografía de lapso de tiempo de los cambios de un blastocisto intacto durante la exposición a la solución de equilibrio. Imágenes individuales se registraron cada 20 segundos. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: microfotografía de lapso de tiempo de los cambios de un blastocisto artificial colapsado durante la exposición a la solución de equilibrio. Imágenes individuales se registraron cada 20 segundos. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Time-lapse microfotografía de los cambios de un blastocisto intacto durante el calentamiento recoverypost. Imágenes individuales se registraron cada 5 minutos. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Time-lapse microfotografía de los cambios de un blastocisto colapsado durante el calentamiento recoverypost. Imágenes individuales se registraron cada 5 minutos. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: visualización de una sola medición del área transversal de un blastocito. El blastocisto está rodeado con cuidado con la herramienta de selección adecuada en el software de análisis de vídeo. La zona pelúcida es siempre excluida de la medición. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: representación de los cambios en la superficie transversal de un blastocisto intacto. Estos paneles muestran la representación de los cambios en la superficie transversal de un blastocisto intacto durante la exposición a la solución de equilibrado (A) vitrificación y (B) durante la recuperación post calentamiento. Las unidades de la superficie transversal son en relación con el área transversal del blastocisto inicial antes de vitrificación. La línea punteada que conecta los paneles A y B es imaginaria, que representa los cambios durante la vitrificación, enfriamiento a-196 ° C y calentamiento a 37 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: representación de los cambios en la superficie transversal del blastocisto colapsado. Estos paneles muestran la representación de los cambios en el área transversal (A) un blastocisto colapsado durante la exposición a la solución de equilibrado (B) en vitrificación y (C) durante la recuperación post calentamiento. Las unidades de la superficie transversal son en relación con el área transversal del blastocisto inicial antes de derrumbarse y la vitrificación. La línea discontinua en el panel A imaginario y representa el punto de partida y final durante el colapso de blastocisto. También la línea punteada imaginaria entre los paneles B y C, representa los cambios durante la vitrificación, enfriamiento a-196 ° C y calentamiento a 37 ° C. Sólo las líneas sólidas en los paneles B y C son el resultado de mediciones reales de la superficie transversal durante el proceso de recuperación y equilibrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: representación gráfica de los diferentes patrones de recuperación de blastocisto después de calentarlo. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: video Time-lapse de los cambios de un blastocisto intacto durante la exposición a la solución de equilibrio. El video representa los cambios, que duran casi 10 minutos en tiempo real. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 2: video Time-lapse de los cambios de un blastocisto colapsado durante la exposición a la solución de equilibrio. El video representa los cambios, que duran casi 10 minutos en tiempo real. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
El protocolo para la observación de la morfodinámica del blastocisto durante y después de criopreservación puede también llevarse a cabo mediante el uso de instrumentos similares y herramientas de software de otros fabricantes. Sistemas Time-lapse para embriología permiten el monitoreo continuo del desarrollo embrionario. El propósito de este trabajo fue introducir la cuantificación del comportamiento del blastocisto durante la preparación de blastocistos para vitrificación y después de su calentamiento. Esto se realizó mediante la medición objetiva de los cambios en la morfología en un plazo de tiempo. Resultados obtenidos de estas mediciones se pueden analizar matemáticamente y en comparación con otros resultados. Entre los parámetros que pueden ser seguidos por el protocolo descrito son los cambios en el tamaño del blastocisto, su interior de la célula, el blastocoel, o zona pelúcida dentro de cierto período de tiempo. El tamaño puede mostrarse como la superficie de la sección transversal de blastocisto más grande, el diámetro o circunferencia de blastocisto y, después del cálculo, así como su volumen.
En estudios previos utilizando sistemas Time-lapse, se realizaron mediciones de velocidad de expansión de blastocoel solamente en embriones frescos11. En blastocistos vitrificados/calentados, sólo los tamaños de los blastocistos fueron medidos inmediatamente después del calentamiento y antes de la transferencia de embriones, o se analizó el período de tiempo en el cual calentó blastocistos expandido nuevamente por completo a la zona pelúcida9,10 . Más dinámica de re-expansión de blastocisto fueron analizado solamente en nuestro anterior estudio8. En este estudio, el protocolo morfométricos ya se ha utilizado para rastrear la velocidad y el patrón de blastocisto re-expansiones después de calentarlo. Aunque estos biomarcadores de crecimiento del blastocisto han demostrado no tener un alto valor predictivo para la implantación, puede utilizarse para la comparación del potencial de recuperación de blastocisto después de la vitrificación y el calentamiento con criopreservación diferentes medios y protocolos . Es decir, las mayores contracciones del blastocisto durante blastocoel re-expansión indican la debilidad de la capa de trophectodermal que podría ser causada durante la criopreservación y su incapacidad para soportar la presión ejercida por el blastocoel llena de líquido.
El protocolo descrito morfométricos puede proporcionar muchos Analisis comparativo adicionales del comportamiento de blastocisto, no solamente después de la criopreservación, midiendo la velocidad y la intensidad de los cambios en volumen, el número de contracciones del blastocoel parcial o total blastocisto se derrumba, el tiempo total blastocoel re-expansión, o la eclosión. Por otra parte, también puede ser utilizado durante las fases de previtrification para determinar el momento más óptimo de la exposición de blastocisto a distintas concentraciones de crioprotectores, como fue presentado en los resultados. Vanderzwalmen et al demostró en ovocitos de ratones que vitrificación también puede tener éxito si la presión osmótica intracelular no alcanza un equilibrio con la solución de crioprotector externo12. La fase solamente problemática para la grabación de blastocistos durante la preservación es el período de solución de vitrificación por tiempo limitado; el embrión tiene que ser expuesto a una mayor concentración de crioprotectores y embalado en la paja en menos de 90 segundos. Para estas mediciones, se recomendarían para utilizar solamente blastocistos que son donados para la investigación. Sin embargo, blastocistos clínicamente disponibles pueden ser registrado y medido otra vez inmediatamente después del calentamiento, con el objetivo de observar cómo se comportan en dilución y soluciones de lavado. Inmediatamente después de una transferencia de blastocisto de la solución de lavado en el medio de recuperación, blastocistos tienden a flotar fuera de la parte inferior. Esto puede representar una dificultad para mantener el embrión en el mismo plano focal durante la grabación. Para resolver este problema, se recomienda preparar un plato con gotas aplanadas de medio. Un problema similar ha sido observado por Vanderzwalmen et al. 12.
En futuras investigaciones, sería útil estudiar si podría reducirse la duración de la exposición de blastocistos artificialmente colapsadas a crioprotectores, minimizando en consecuencia el efecto tóxico de estas sustancias químicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es una parte de investigación programa P3-0327 e investigación J3-7177, fundada por la Fundación de investigación de Eslovenia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
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- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
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