Her, viser vi metoder for i vivo kvantificering af leukocyt afstigning fra naiv, betændt, og ondartet murine hud. Vi udføre en head-to-head sammenligning af to modeller: transdermal FITC ansøgning og i situ photoconversion. Derudover viser vi nytte af photoconversion for sporing leukocyt afstigning fra kutane tumorer.
Leukocyt afstigning fra perifere væv til afdrypning lymfeknuder er ikke kun afgørende for immun overvågning og indledning, men også bidrager til løsningen af perifere væv svar. Mens en række metoder bruges til at kvantificere leukocyt afstigning fra ikke-lymfoide, perifere væv, forbliver de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer kontekst-afhængige egress dårligt forstået. Her, beskriver vi brugen af i situ photoconversion til kvantitativ analyse af leukocyt afstigning fra murine hud og tumorer. Photoconversion giver mulighed for direkte mærkning af leukocytter bopæl inden for kutant væv. Selvom huden udsættes for ultraviolet lys inducerer lokale karakteriseret inflammatoriske respons ved leukocyt infiltrater og kar leakiness, i et head-to-head sammenligning med transdermal anvendelse af fluorescerende sporstoffer, photoconversion specifikt mærket vandrende dendritiske cellepopulationer og samtidig aktiveret kvantificering af myeloid og lymfoide afstigning fra kutan microenvironments og tumorer. Mekanismer af leukocyt egress forblive en manglende komponent i vores forståelse af intratumoral leukocyt kompleksitet, og dermed anvendelse af de værktøjer, der beskrives heri vil give unikke indsigt i dynamikken i tumor immun microenvironments begge på stabil stat og som svar på terapi.
Perifere væv immunrespons er formet af leukocyt rekruttering til lokaliteterne af betændelse, men også af mekanismer, der regulerer deres efterfølgende ejendomsforbehold. Således er beskyttende immunitet dikteret af kumulative cellulære og molekylære mekanismer, der bestemmer, om en leukocyt træder, forbliver inden for, eller rettere vandrer ud af perifere væv via lymfekar. Vigtigere, er tilbøjelighed for leukocytter at afslutte væv gennem lymfekar (betegnes afstigning) knyttet til deres specialiserede funktioner. Dendritiske celler (DC) erhverve vandrende adfærd som reaktion på modning signaler fører til antigen transport og præsentation i dræning lymfeknuder (dLN), en proces, der er nødvendige for adaptive immunitet1. Scavenging myeloide celler, makrofager og neutrofiler, tjene til klart apoptotiske vragrester gennem fagocytose. Under bakteriel infektion, neutrofiler egress væv og i sidste ende gennemgå apoptose i dLNs2 og i en model af DSS-induceret colitis, data støtter den hypotese, at makrofag egress er nødvendigt at løse lokale betændelse3. Om neutrofile og makrofag udgang sker i alle inflammatoriske sammenhænge, dog er ukendt. Beviser for T-lymfocytter afstigning fra steady state4,5,6,7, inficerede8og betændte4,9,10, 11,12 perifer, ikke-lymfoide væv angiver at recirkulere T celler aktivt, selvom de væv-baserede signaler, der driver denne exit forbliver dårligt forstået. Flere undersøgelser har identificeret signaler nødvendige for retningsbestemt overgangen til afdrypning lymfatisk kapillærer og efterfølgende egress herunder chemokine (C-C motiv) ligand 21 (CCL21) og dens receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motiv) ligand 12 (CXCL12) og dens receptor CXCR42,14, og sphingosine-1-fosfat (S1P)10,15,16. Disse mekanismer er ikke aktiv i alle sammenhænge, dog, og hvorvidt de bestemmer afstigning af alle celletyper forbliver et åbent spørgsmål. Vigtigere, yderligere kræver indsigt i de mekanismer, der styrer egress og funktionelle relevans i sygdom kvantitative i vivo metoder til analyse.
Flere metoder er blevet brugt til at kvantificere egress i flere dyremodeller i vivo herunder direkte cannulation af lymfekar, adoptiv overførsel af ex vivo mærket leukocytter, transdermal anvendelse af fluorescerende sporstoffer, injektion af mærket partikler, og i vivo photoconversion17,18. Direkte cannulation af afferente mus lymfekar er vanskeligt og begrænset i små dyr af mængden af væske, der kan indsamles. Cannulation er således i vid udstrækning udført i store dyr (fx., får) hvor sådanne kirurgiske manipulationer er praktisk. Disse undersøgelser giver direkte beviser for forekomsten af lymfoide og myeloide celler i lymfeknuder10,19,20. Derudover afslører får modeller, at akut og kronisk inflammation steget næsten 100-fold10,21lymfocyt tilstedeværelse i lymfeknuder.
Adoptiv overførsel af mærket og genetisk manipulerede lymfocytter har vigtigere afslørede, at CCR7 er nødvendig for afstigning af CD4+ T celler fra akut betændt hud5,11, mens forbehandling af lymfocytter med den lille molekyle S1P receptor agonist hæmmer FTY720, kun delvist deres udgang10. Interessant, afstigning af overførte lymfocytter fra kronisk betændte hud er CCR7-uafhængig10, men kan delvist kræve CXCR49. Adoptiv overførsel eksperimenter, dog levere ikke-fysiologisk numre af ex vivo aktiveret og mærket lymfocytter i væv gennem indsprøjtning, som ændrer den biomekaniske miljø af væv og forhøjede interstitiel væske pres det åbne oprindelige lymfatisk kapillærer og ændre deres transport egenskaber22. Som et alternativ, transdermal anvendelse af fluorescein isothiocyanat (FITC) i tilstedeværelse eller fravær af dermal irritanter (fx., dibutylphthalat, DBP) eller infektion23,24 giver mulighed for sporing af fagocyterende celler, der ophobes tracer og overføre til dLNs. Ligeledes er fluorescently mærket tumorer et middel til at spore fagocyterende celler, som har opslugt tumor materielle25. Disse metoder har givet vigtige indsigt i de mekanismer, der regulerer DC udgang13,14,17,26,27 , men ikke er i stand til at spore ikke-fagocyterende lymfocytter og fortolkning kan blive kompliceret af gratis lymfedrænage af opløselige FITC således mærkning ikke-trækfugl, LN bosiddende DCs.
Alternativt, intravital mikroskopi er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for i vivo sporing af fysiologisk relevante leukocyt populationer i realtid28,29. Anvendes i kombination med reporter mus og antistof-baseret i vivo immunfluorescent mærkning, intravital mikroskopi har afsløret den komplekse rumlige og tidsmæssige dynamikken i immun celle menneskehandel, herunder intramuskulært migration30 , transmigration på tværs af lymfatisk endothelium, passage i lymfe lumen, og migration på LN posten28,31. Bred vedtagelsen af intravital billeddiagnostiske teknikker er begrænset af bekostning, nødvendige ekspertise til nedsat, og begrænset overførselshastighed for kvantificering af flere celletyper. Stadig, kobling kvantitative metoder, der analyserer populationsdynamik væv med intravital imaging vil give yderligere og vigtig mekanistiske indblik med hensyn til mekanismerne i motilitet og migration mod og inden for lymfatisk kapillærer 18 , 31 , 32.
Derfor, i vivo photoconversion er opstået som en metode, der giver mulighed for i situ mærkning, uafhængig af Fagocytisk aktivitet og til kvantificering af fysiologiske leukocyt udgang (når kombineret med flowcytometri) i den fravær eller tilstedeværelse af udfordring. Kaede-Tg mus udtrykke constitutively et protein, der er isoleret fra stony koral, der udstiller grønne fluorescens (Kaede grøn) indtil udsat for ultraviolet lys, hvorefter det uigenkaldeligt konverterer til røde fluorescens (Kaede rød)33. Photoconverted celler kan spores som de udgangsdøre fra perifere væv websteder og ophobes i dLNs. Dette og andre lignende photoconvertible mus modeller34,35 har afsløret vigtigt biologi herunder konstitutiv afstigning af regulerende T-celler fra huden36, CXCR4 afhænger af B-celle afstigning fra Peyerske37 , mobilisering af bopæl hukommelse T celler ved peptid re-udfordring38og bred leukocyt afstigning fra tumor microenvironments39. Heri, udfører vi en head-to-head sammenligning af photoconversion med transdermal FITC ansøgning inden for rammerne af kutane betændelse og infektion at muliggøre direkte sammenligning af eksisterende data med metoden photoconvertible. Desuden, vi viser photoconversion i implanterede tumorer og beskrive konverteringseffektivitet og selektiv afstigning fra tumor microenvironments. Som sådan, vi argumentere for, at der er behov for yderligere anvendelse af disse metoder til at belyse den kritiske biologi af leukocyt afstigning fra tumorer, som vil få betydelige følger for at fortolke intratumoral leukocyt kompleksitet, anti-tumor immunitet, og svar til terapi.
Selvom leukocyt afstigning fra perifer, ikke-lymfoide væv er kritisk for indledningen og opløsning af immunrespons, er de molekylære mekanismer, der styrer egress dårligt forstået. Denne forskel i viden er i vid udstrækning klar tilgængelighed af værktøjer til kvantificering in vivo. Her, beskriver vi brugen af photoconvertible mus (Kaede-Tg) at kvantificere endogene leukocyt afstigning fra huden og tumorer og give en direkte head-to-head sammenligning med FITC maling i inflammatoriske og infektion mode…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Marcus Bosenberg for at give LÆK 1.1 og LÆK 1.7 murine melanom linjer og Dr. Deborah J. Fowell for at give B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr mus efter aftale med RIKEN BRC gennem den nationale Bio-ressource af MEXT, Japan.
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
DNase | Roche | 4536282001 | |
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
HBSS | Caisson | HBL06 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
FlowJo v10 Software | FlowJo |