Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores
Summary
Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.
Abstract
Salida de leucocitos de tejidos periféricos a los ganglios linfáticos drenantes no sólo es fundamental para la vigilancia inmune e iniciación sino también contribuye a la resolución de las respuestas del tejido periférico. Mientras que una variedad de métodos se utilizan para cuantificar la salida de leucocitos de tejidos no-linfoides, periféricos, los mecanismos celulares y moleculares que rigen la salida dependiente del contexto siguen siendo mal entendidos. Aquí, describimos el uso de photoconversion en situ para el análisis cuantitativo de la salida de leucocitos de piel murina y tumores. Photoconversion permite la directa etiquetado de leucocitos residente dentro del tejido cutáneo. Aunque la exposición a luz ultravioleta induce local las respuestas inflamatorias caracterizan por infiltrados de leucocitos y filtración vascular, en una comparación directa con aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, photoconversion específicamente etiquetado las poblaciones migratorias dendrítico de la célula y al mismo tiempo permitió la cuantificación de salida mieloide y linfoide de microambientes cutáneas y tumores. Los mecanismos de salida de leucocitos siguen siendo un componente faltante en nuestra comprensión de la complejidad de leucocito intratumoral, y así la aplicación de las herramientas descritas en este documento proporcionará una visión única en la dinámica de tumor inmunes microambientes ambos en constante estado y en respuesta a la terapia.
Introduction
Las respuestas inmunitarias de tejido periférico están conformadas no sólo por el reclutamiento de leucocitos a los sitios de inflamación, sino también por los mecanismos que regulan su retención posterior. Por lo tanto, inmunidad protectora es dictada por acumulativos mecanismos celulares y moleculares que determinan si entra a un leucocito, permanece dentro, o más bien emigra de tejido periférico vía los recipientes linfáticos. Lo importante es la propensión de leucocitos al tejido a través de vasos linfáticos (denominada salida) la salida está ligada a sus funciones especializadas. Las células dendríticas (DC) adquieran comportamiento migratorio en respuesta a señales de maduración conduce al transporte del antígeno y presentación en el drenaje de los ganglios linfáticos (dLN), un proceso que es necesario para la inmunidad adaptativa1. Barrido de las células mieloides, tales como los macrófagos y neutrófilos, sirven para limpiar escombros de apoptosis a través de la fagocitosis. Durante una infección bacteriana, neutrófilos salida del tejido y en última instancia sufren apoptosis en dLNs2 y en un modelo de colitis inducida por DSS, datos apoyan la hipótesis de que la salida de macrófagos es necesaria para resolver la inflamación local3. Si se produce la salida de neutrófilos y macrófagos en todos los contextos inflamatorios, sin embargo, se desconoce. Evidencia de la salida de linfocitos T de estado estacionario4,5,6,7, infectados8y inflamada4,9,10, 11,12 los tejidos no-linfoides, periférico indica que las células T se recirculan activamente, aunque mal entendidas las señales basadas en el tejido que esta salida. Varios estudios han identificado las señales necesarias para la migración direccional hacia los capilares linfáticos de drenaje y posterior salida incluyendo chemokine (C-C motif) ligando 21 (CCL21) y su receptor CCR74,11, 13, ligando de chemokine (adorno de C-X-C) 12 (CXCL12) y su receptor CXCR42,14y esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Sin embargo, estos mecanismos no están activos en todos los contextos, y si determinan la salida de todos los tipos de la célula sigue siendo una incógnita. Lo importante, más penetración en los mecanismos que rigen la salida y su relevancia funcional en la enfermedad requiere cuantitativa en vivo métodos de análisis.
Varios métodos se han utilizado para cuantificar la salida en varios modelos animales en vivo , incluyendo la canulación directa de los vasos linfáticos, transferencia adoptiva de ex vivo etiquetados leucocitos, aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, inyección de partículas marcadas y en vivo photoconversion17,18. La canulación directa de los vasos linfáticos aferentes ratón es difícil y limitado en pequeños animales por los volúmenes de líquido que puede ser acumulado. Así, la canalización se ha realizado en gran parte en grandes animales (e.g., ovejas) donde tales manipulaciones quirúrgicas son prácticas. Estos estudios proporcionan evidencia directa de la presencia de células linfoides y mieloides en linfa10,19,20. Además, ovinos modelos revelan que la inflamación aguda y crónica incrementaron la presencia de linfocitos en los ganglios linfáticos casi 100-fold10,21.
Transferencia adoptiva de linfocitos genéticamente manipulados y etiquetados ha revelado lo importante que CCR7 se requiere para la salida de CD4+ T de las células de la piel agudo inflamada5,11, mientras que el tratamiento previo de los linfocitos con la pequeña molécula agonista de receptor de S1P, FTY720, inhibe parcialmente su salida10. Curiosamente, la salida de linfocitos transferidos de piel crónicamente inflamada es CCR7-independiente10, pero puede requerir parcialmente CXCR49. Experimentos de transferencia adoptiva, sin embargo, entregan a números no fisiológica de ex vivo los linfocitos activados y etiquetados en tejido a través de la inyección, que altera el ambiente biomecánico de los tejidos y elevadas presiones de fluido intersticiales abrir los capilares linfáticos iniciales y alterar sus propiedades de transporte22. Como alternativa, aplicación transdérmica de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en la presencia o ausencia de irritantes cutáneos (por ej., ftalato de dibutilo, DBP) o infección23,24 permite el seguimiento de los células fagocíticas que acumulan tracer y migran a dLNs. Del mismo modo, fluorescencia etiquetados tumores proporcionan un medio para rastrear las células fagocíticas que han engullido tumor material25. Estos métodos han proporcionado importante información sobre los mecanismos que gobiernan DC salida13,14,17,26,27 pero son incapaces de seguir no fagocíticas los linfocitos y, la interpretación se pueden complicar por drenaje linfático libre de FITC soluble así etiquetado no migratorias, DCs residente LN.
Por otra parte, la microscopia intravital es una poderosa herramienta que permite el seguimiento en vivo de las poblaciones de leucocitos fisiológicamente relevante en tiempo real28,29. Se usa en combinación con los ratones de reportero y basados en anticuerpos en vivo inmunofluorescente etiquetado intravital microscopía ha puesto de manifiesto el complejo espacial y dinámica temporal de inmune celular trata de personas, incluyendo migración intersticial30 , transmigración a través del endotelio linfático, pasaje dentro de la luz linfática y la migración a LN entrada28,31. Amplia adopción de técnicas de imagen intravital está limitado por el costo, conocimientos necesarios para la instalación y limitado rendimiento para la cuantificación de múltiples tipos de células. Todavía, acoplamiento de métodos cuantitativos que analizan la dinámica de la población los tejidos con la proyección de imagen intravital proporcionará visión mecanicista adicional e importante con respecto a los mecanismos de la movilidad y la migración hacia y dentro de los capilares linfáticos 18 , 31 , 32.
En consecuencia, photoconversion en vivo se ha convertido en un método que permite en situ etiquetado, independiente de la actividad fagocítica y para la cuantificación de la salida de leucocitos fisiológica (cuando está juntado con citometría de flujo) en el ausencia o presencia de desafío. Ratones de Kaede-Tg constitutivamente expresan una proteína aislada de corales pétreos que exhibe fluorescencia verde (Kaede verde) hasta que se expone a la luz violeta, después de lo cual convierte irreversiblemente a fluorescencia roja (Kaede rojo)33. Las células Photoconverted pueden ser rastreadas como que salida de sitios de tejido periférico y se acumulan en dLNs. Esto y otros similares photoconvertible ratón modelos34,35 han revelado importante biología incluyendo salida constitutiva de las células T reguladoras de piel36, salida de la célula de B de CXCR4-dependiente de placas de Peyer37 , movilización de las células T de memoria residente péptido nuevo reto38y salida amplia del leucocito de tumor microambientes39. En este documento, realizamos una comparación directa de photoconversion con aplicación de FITC transdérmica en el contexto de la inflamación cutánea e infección para permitir la comparación directa de los datos existentes con el método photoconvertible. Además, demostrar photoconversion en tumores implantados y describir la eficiencia de conversión y salida selectiva de microambientes de tumor. Por lo tanto, sostenemos que más aplicación de estos métodos es necesario dilucidar la biología fundamental de salida de leucocitos de tumores, que tendrá implicaciones significativas para interpretar la complejidad del leucocito de intratumoral, inmunidad antitumoral y respuesta a la terapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque la salida de leucocitos de los tejidos periféricos, no-linfoides es crítica para la iniciación y resolución de la respuesta inmune, los mecanismos moleculares que rigen la salida son poco conocidos. Esta brecha en el conocimiento es en gran parte debido a la disponibilidad lista de herramientas para la cuantificación in vivo. Aquí, describimos el uso de ratones photoconvertible (Kaede-Tg) para cuantificar la salida de leucocitos endógena de la piel y tumores y proporcionar una comparación directa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Dr. Marcus Bosenberg por prever líneas de melanoma murino YUMM 1.7 y 1.1 YUMM y Dr. Deborah J. Fowell proporcionando B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) ratones 15Utr acuerdo con RIKEN BRC a través de los Bio-recursos nacionales de MEXT, Japón.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
- D’Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
- Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
- Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
- Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
- Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
- Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
- Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
- Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
- Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
- Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
- Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
- Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
- Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
- Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
- Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
- Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
- Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
- Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
- Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
- Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
- Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
- Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
- Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
- Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
- Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer’s patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
- Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
- Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
- Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
- Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
- Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
- Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
- Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
- Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
- Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
- Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
