Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının
Summary
Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.
Abstract
Periferik dokulara gelen lökosit çıkış drenaj lenf düğümleri için sadece immün gözetim ve başlatma için kritik değil ama ayrıca periferik doku yanıt olarak çözümlenmesini katkıda bulunur. Çeşitli yöntemler kullanılır lökosit çıkış lenfoid sigara, periferik dokulara üzerinden ölçmek için içerik bağımlı çıkış yöneten hücresel ve moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. Burada, biz Nicel analiz lökosit çıkış fare deri ve tümörleri, in situ photoconversion nasıl kullanılacağını açıklar. Photoconversion doğrudan lökosit kutanöz doku içinde ikamet etiketleme için sağlar. Cilt ışığa maruz kalma menekşe yerel indükler rağmen inflamatuar yanıt lökosit infiltratlar ve floresan izleyiciler, transdermal uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması vasküler leakiness photoconversion özellikle ile karakterize göçmen dendritik hücre popülasyonlarının etiketli ve kutanöz microenvironments ve tümör myeloid ve lenfoid çıkış miktar aynı anda etkin. Lökosit çıkış mekanizmaları anlayışımız intratumoral lökosit karmaşıklık içinde eksik bir bileşeni olarak kalır ve böylece uygulama burada açıklanan araçları bağışıklık microenvironments tümör dinamikleri benzersiz bir anlayış sağlayacak Devlet ve tedaviye yanıt yükseliyor.
Introduction
Periferik doku bağışıklık yanıtı sadece sitelerine lökosit alımı iltihap tarafından aynı zamanda onların sonraki bekletme düzenleyen mekanizmalar tarafından şekillenir. Böylece, koruyucu bağışıklık kalır içinde ister bir lökosit girer, ya da daha doğrusu geçirir lenf damarları ile periferik doku dışında belirlemek toplu hücresel ve moleküler mekanizmaları tarafından dikte edilir. Önemlisi, doku (çıkış olarak adlandırdığı) lenf damarları ile çıkmak lökosit için eğilimi onların özel işlevlere bağlıdır. Dendritik hücreler (DC) yanıt olarak olgunlaşma sinyalleri antijen taşıma ve edinilmiş bağışıklığın1için gerekli olan bir işlemi lenf düğümleri (dLN), drenaj içinde tanıtımı için önde gelen göçmen davranış elde etmek. Makrofajlar ve nötrofiller, gibi atma myeloid hücrelerin apoptotik enkaz fagositoz ile temizlemek için hizmet vermektedir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında nötrofil doku çıkış ve sonuçta apoptosis dLNs2 ve kolit DSS kaynaklı bir model geçmesi, veri makrofaj çıkış yerel iltihap3gidermek için gerekli olan hipotezi destekler. Olup tüm inflamatuar bağlamlarda, nötrofil ve makrofaj çıkış oluşur ancak bilinmemektedir. Kanıt için T lenfosit çıkış kararlı duruma4,5,6,7, virüslü8ve iltihaplı4,9,10, 11,12 periferik, Sigara-lenfoid doku gösterir T hücreleri aktif olarak recirculate, bu çıkış sürücü doku tabanlı sinyalleri kötü anlaşılır kalır rağmen. Çeşitli çalışmalarda belirledik sinyalleri lenfatik kapiller boşaltma doğru yönlü geçiş için gerekli ve sonraki çıkış kemokin (C-C motifi) ligand de dahil olmak üzere 21 (CCL21) ve onun reseptör CCR74,11, 13, kemokin (C-X-C motifi) ligand 12 (CXCL12) ve reseptör CXCR42,14ve sphingosine-1-fosfat (S1P)10,15,16. Bu mekanizmalar tüm bağlamlarda etkin değildir ve olup tüm hücre tiplerinin çıkış belirlemek bir açık soru kalır. Önemlisi, daha fazla çıkış ve fonksiyonel önemini hastalığında yöneten mekanizmaları içgörü nicel vivo içinde analiz yöntemleri gerektirir.
Doğrudan cannulation lenf damarlarının, lökosit, etiketli ex vivo transdermal uygulama floresan izleyiciler, evlat edinen transferi dahil olmak üzere birden fazla hayvan modelleri vivo içinde çıkış ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır, Enjeksiyon etiketli parçacıklar ve in vivo photoconversion17,18. Afferent fare lenf damarları doğrudan cannulation zor ve küçük hayvanlarda sıvı toplanabilir birimler tarafından sınırlı. Böylece, cannulation büyük ölçüde büyük hayvanlarda yapılmıştır (Örn., koyun) gibi cerrahi işlemler nerede pratik. Bu çalışmalar lenf10,19,20lenfoid ve myeloid hücrelerin varlığı için doğrudan kanıt sağlar. Ayrıca, ovine modelleri akut ve kronik inflamasyon lenf lenfosit varlığı neredeyse 100-fold10,21tarafından artış ortaya koyuyor.
Etiketli ve genetik olarak işlenmiş lenfositlerin evlat edinen transfer, CCR7 CD4 çıkış için gerekli olduğunu da önemlisi koymuştur+ T hücreleri Akut iltihaplı cilt5,11, lenfositler ön süre S1P reseptör agonist küçük molekül ile FTY720, yalnızca kısmen onların çıkış10engeller. İlginçtir, kronik iltihaplı deri üzerinden transfer edilen lenfositlerin çıkış CCR7 bağımsız10, ama kısmen CXCR49gerektirebilir. Evlat edinen transfer deneyler, ancak, aktif ve etiketli lenfositler doku doku ve yükseltilmiş interstisyel sıvı basıncı biyomekanik ortamı değiştirir enjeksiyon ile içine ex vivo fizyolojik olmayan sayıda teslim Bu ilk lenfatik kapiller açın ve onların taşıma özellikleri22alter. Floresein isothiocyanate (FITC) varlığı veya yokluğu dermal tahriş edici bir alternatif, transdermal uygulama olarak (Örn., Dibutil ftalat, DBP) veya enfeksiyon23,24 için izleme sağlar İzleyici biriken ve dLNs için göç fagositik hücreler. Benzer şekilde, fluorescently etiketli tümör tümör malzeme25yuttu fagositik hücreleri izlemek için bir yol sağlar. Bu yöntemler DC çıkış13,14,17,26,27 yöneten ancak olmayan fagositik takip edemiyoruz mekanizmalarının içine önemli fikir vermiş lenfositler ve yorumu çözünür FITC LN ikamet DCs böylece göçmen olmayan-etiketleme ücretsiz lenfatik drenaj tarafından karmaşık.
Alternatif olarak, intravital mikroskobu vivo içinde izleme gerçek zamanlı28,29fizyolojik ilgili lökosit nüfusun sağlayan güçlü bir araçtır. Mikroskopi kompleks kayma ortaya koymuştur ile birlikte muhabir fareler ve antikor tabanlı vivo içinde immünfloresan etiketleme, intravital kullanılan ve ticareti, dahil interstisyel geçiş30 bağışıklık zamansal dinamiği hücre , hicret arasında lenfatik endotel, geçit lenfatik lümen ve geçiş sonucunda LN giriş28,31içinde. İntravital görüntüleme teknikleri geniş kabulü gider, kurmak, için gerekli uzmanlık ile sınırlıdır ve birden çok hücre tipleri miktarının için çıkışını sınırlı. Yine de, nüfus dinamikleri analiz nicel metodlar kaplin intravital görüntüleme kurcalayarak geçiş doğru ve lenfatik kapiller içinde ve hareket mekanizmaları ile ilgili olarak ek ve önemli mekanik kavrama sağlayacak 18 , 31 , 32.
Sonuç olarak, in vivo photoconversion in situ etiketleme için izin veren bir yöntem olarak fagositik aktivite ve (akış sitometresi ile birleştiğinde) fizyolojik lökosit çıkış miktar için bağımsız ortaya çıkmıştır Devamsızlık veya meydan okuma varlığı. Kaede-Tg fareler yapısal mor ışık, sonra geri dönüşümsüz kırmızı floresans (Kaede kırmızı)33‘ e dönüştürür maruz kadar yeşil floresan (Kaede yeşil) sergiler taşlı mercan dan izole bir protein hızlı. Photoconverted hücrelerin periferik doku sitelerden çıkış olarak izleniyor ve dLNs içinde birikir. Bu ve diğer benzer photoconvertible fare modelleri34,35 önemli biyoloji bünye çıkış düzenleyici T hücreleri cilt36, CXCR4 bağımlı B hücre çıkış Peyer’s yamalar37 üzerinden de dahil olmak üzere indirdik , peptid yeniden meydan38ve geniş lökosit çıkış tümör microenvironments39üzerine sakin bellek T hücrelerinin seferberlik. Burada, kutanöz inflamasyon ve enfeksiyon varolan verileri doğrudan karşılaştırma için photoconvertible yöntemi ile izin bağlamında photoconversion transdermal FITC uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, implante tümörler photoconversion göstermek ve dönüşüm verimliliği ve tümör microenvironments üzerinden seçici çıkış açıklayın. Bu nedenle, biz daha fazla uygulama bu yöntemlerin lökosit çıkış intratumoral lökosit karmaşıklığı, anti-tümör dokunulmazlık, yorumlamak için önemli etkileri olacaktır tümörler üzerinden kritik biyoloji aydınlatmak için gerekli olduğunu iddia ve tedaviye yanıt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lökosit çıkış periferik, Sigara-lenfoid doku üzerinden kritik başlatma ve bağışıklık yanıtı çözümlenmesi için olsa da, çıkış düzenleyen moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır. Bilgi serisindeki bu boşluğun miktar içinde vivoiçin araçları hazır kullanılabilirliğini büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Burada, photoconvertible fareler (Kaede-Tg) endojen lökosit çıkış deri ve tümör ölçmek ve inflamatuar FITC boya ile doğrudan kafa kafaya karşılaştırma sağlamak i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr. Marcus Bosenberg YUMM 1.1 ve YUMM 1.7 fare Melanom hatları ve Dr Deborah J. Fowell B6 sağlamak için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr fareler RIKEN BRC aracılığıyla Ulusal biyo-kaynak olduğunu MEXT, Japonya ile anlaşma.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
- D’Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
- Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
- Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
- Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
- Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
- Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
- Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
- Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
- Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
- Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
- Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
- Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
- Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
- Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
- Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
- Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
- Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
- Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
- Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
- Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
- Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
- Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
- Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
- Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
- Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer’s patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
- Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
- Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
- Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
- Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
- Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
- Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
- Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
- Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
- Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
- Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
