Количественное определение лейкоцитарной выход через лимфатические сосуды из мышиных кожи и опухоли
Summary
Здесь мы продемонстрировать методы в vivo подсчета лейкоцитов выхода из наивно, воспаление, и злокачественные мышиных кожи. Мы выполняем голова к голове сравнения двух моделей: Трансдермальные FITC приложения и на месте photoconversion. Кроме того мы демонстрируем утилита photoconversion для отслеживания лейкоцита выход из кожные опухоли.
Abstract
Лейкоцита выхода из периферических тканей для слива лимфатические узлы не только крайне важное значение для иммунной наблюдения и посвящения, но и способствует резолюции реакции периферических тканей. Хотя различные методы используются для количественного определения лейкоцита выхода из не лимфоидной, периферических тканях, клеточном и молекулярном механизмы, которые управляют контекстно зависимые выход по-прежнему осознаются. Здесь мы описывают использование в местах photoconversion для количественного анализа лейкоцита выхода из мышиных кожи и опухоли. Photoconversion позволяет прямой маркировки лейкоциты-резидентов в кожные ткани. Хотя воздействие фиолетового света на кожу стимулирует местных воспалительных реакций характерны лейкоцита инфильтраты и сосудистые утечки, в прямом сравнении с трансдермального применения люминесцентных индикаторов, photoconversion специально помечены мигрирующие дендритные клетки населения и одновременно позволило количественная оценка миелоидного и лимфоидных выхода из кожный микросреды и опухоли. Механизмы лейкоцита выход остаются отсутствующий компонент в нашем понимании сложности внутриопухолевых лейкоцитов, и таким образом применение инструментов, описанных в данном документе даст уникальную возможность заглянуть в динамике опухоли иммунной микросреды оба на ровное и в ответ на терапию.
Introduction
Периферических тканей иммунной реакции формируются не только набора лейкоцитов к местам воспаления, но и механизмов, которые регулируют их последующего хранения. Таким образом защитный иммунитет диктуется накопительное клеточной и молекулярной механизмов, которые определяют ли лейкоцита входит, остается внутри, или скорее мигрирует из периферических тканей через лимфатические сосуды. Важно отметить, что склонность к лейкоцитов для выхода из ткани через лимфатические сосуды (называется выход) связано с их специализированных функций. Дендритные клетки (DC) приобрести мигрирующих поведение в ответ на сигналы созревания, ведущих к антигену транспорта и презентации в дренаж лимфатических узлов (dLN), процесс, который необходим для адаптивного иммунитета1. Очистки миелоидных клеток, такие как макрофаги и нейтрофилы, служат для очистки мусора apoptotic через фагоцитоза. При бактериальной инфекции нейтрофилы выход ткани и в конечном счете проходят apoptosis в dLNs2 и модели DSS-индуцированной колита, данных поддерживает гипотеза, что макрофагов выхода необходимо решить местные воспаления3. Происходит ли выход нейтрофилов и макрофагов во всех контекстах воспалительных, однако, неизвестно. Доказательства для Т-лимфоцитов выхода из устойчивого состояния4,5,6,7, зараженных8и воспаленные4,9,10, 11,12 периферийных, не лимфоидных тканей указывает, что Т-клетки активно рециркуляции, хотя сигналы на основе ткани, которые диск этот выход по-прежнему не ясны. Некоторые исследования выявили сигналов, необходимых для направления миграции в дренаж лимфатических капилляров и последующий выход включая хемокиновых (C-C мотив) лигандом 21 (CCL21) и его рецептор CCR74,11, 13, хемокиновых (C-X-C мотив) лигандом 12 (CXCL12) и его рецептор CXCR42,14и сфингозин-1-фосфата (S1P)10,,1516. Однако эти механизмы не являются активными во всех контекстах, и ли они определяют эвакуация всех типов клеток остается открытым вопрос. Важно понимание механизмов, которые регулируют исходящего трафика и его функциональной значимости в болезни требует количественных в vivo методы анализа.
Некоторые методы были использованы для количественного определения выхода в нескольких животных моделей в естественных условиях , включая прямые катетеризации лимфатических сосудов, приемные передачи ex vivo помечены лейкоцитов, трансдермального применения люминесцентных индикаторов, инъекции помечены частиц, и в естественных условиях photoconversion17,18. Прямые катетеризации мыши афферентные лимфатические сосуды является сложным и ограниченным в мелких животных по объему жидкости, которые могут быть собраны. Таким образом, катетеризации проводилось главным образом в крупных животных (например., овец) где такие хирургические манипуляции практичны. Эти исследования дают прямые доказательства наличия лимфоидных и миелоидных клеток в лимфатических10,19,20. Кроме того овечья модели показывают, острого и хронического воспаления увеличился почти 100-кратного10,21присутствие лимфоцитов лимфатических.
Приемных передачи маркировку и генномодифицированные лимфоцитов главное показали, что CCR7 является обязательным для выхода CD4 клеток+ T от остро воспаленной кожи5,11, во время предварительной обработки лимфоцитов с малые молекулы S1P рецептора агонистом FTY720, лишь частично ингибирует их эвакуация в10. Интересно, что выход передаваемых лимфоцитов из хронически воспаленной кожи CCR7-независимые10, но частично может потребовать CXCR49. Приемных передачи эксперименты, однако, доставить-физиологические количество ex vivo помечены и активированных лимфоцитов в ткани через инъекции, которая изменяет биомеханических окружающей среды тканей и повышенные давление интерстициальной жидкости это открыть первоначальный лимфатических капилляров и изменять их свойства транспорта22. Как альтернатива, применение трансдермальных флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) в присутствии или отсутствии кожных раздражителей (например., дибутилфталат, DBP) или инфекции23,24 позволяет для отслеживания Фагоцитирующих клеток, которые аккумулируют трассирующими и мигрируют на dLNs. Аналогичным образом дневно обозначенные опухоли предоставляют средства для отслеживания фагоцитирующих клеток, которые охватили опухоли материала25. Эти методы предоставляют важные понимание механизмов, которые регулируют DC выход13,14,17,26,27 , но не могут отслеживать не фагоцитарной лимфоциты и интерпретация может быть осложнено бесплатно лимфодренаж растворимых FITC таким образом маркировки не миграционных, LN-резидентов DCs.
В качестве альтернативы прижизненной микроскопии является мощным инструментом, который позволяет для отслеживания в естественных условиях населения физиологически соответствующих лейкоцитов в реальном времени28,29. Используется в сочетании с репортером мышей и на основе антител в vivo immunofluorescent маркировки, прижизненной микроскопии выявило комплекс пространственной и временной динамики иммунных клеток торговли людьми, в том числе интерстициальных миграции30 , переселение через лимфатические эндотелия, проход в лимфатический люмен и миграции при LN запись28,31. Широкое принятие методы прижизненной визуализации ограничивается расходы, необходимые знания для набора и ограниченной пропускной способности для количественной оценки нескольких типов клеток. Тем не менее муфты количественные методы, предназначенные для анализа динамики народонаселения тканей с прижизненной визуализации обеспечит дополнительный и важный механистический понимание в отношении механизмов подвижности и миграции к и внутри лимфатических капилляров 18 , 31 , 32.
Следовательно, в естественных условиях photoconversion возникла как метод, который позволяет в situ обозначая, независимой фагоцитарной активности, а также для количественной оценки физиологической лейкоцита выход (при сочетании с проточной цитометрии) в отсутствие или наличие проблемы. Каэдэ-Tg мышей конститутивно Экспресс белка, изолированный от Стони кораллов, что экспонаты Зеленая флуоресценция (Каэдэ зеленый) до тех пор, пока фиолетовый свет, после чего он необратимо преобразует красной флуоресценцией (Каэдэ красный)33. Photoconverted клетки могут быть отслежены, как они исходящего от периферических тканей сайтов и накапливаются в dLNs. Это и другие34,мыши аналогичные photoconvertible версии модели35 выявили важные биологии включая учредительный ОВВИГ регуляторных клеток T от кожи36, CXCR4-зависимой ячейки B выхода из патчи Пейера в37 , мобилизация резидентная память T клеток пептид повторно вызов38, и широкие лейкоцита выхода из опухоли микросреды39. Здесь мы выполняем голова к голове сравнения photoconversion с FITC трансдермального применения в контексте кожные воспаления и инфекции позволяет для прямого сравнения существующих данных с помощью метода photoconvertible. Кроме того мы продемонстрировать photoconversion в имплантированными опухолями и описать эффективность преобразования и селективного выход от опухоли микросреды. Таким образом, мы утверждаем, что дальнейшее применение этих методов необходима для выяснения критических биологии лейкоцита выход от опухоли, которые будут иметь значительные последствия для интерпретации внутриопухолевых лейкоцита сложности, противоопухолевый иммунитет, и ответ на терапию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя лейкоцита выхода из периферийных устройств, не лимфоидной ткани имеет решающее значение для инициирования и резолюции иммунных реакций, молекулярные механизмы, которые управляют выход плохо понимают. Этот пробел в знаниях объясняется в основном доступность инструментов для кол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Маркуса Bosenberg за предоставление YUMM 1.1 и YUMM 1.7 мышиных меланомы линии и д-р Дебора J. Fowell для предоставления B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr мышей с согласия RIKEN BRC через национальные био-ресурс МПКСНТ, Япония.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
- D’Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
- Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
- Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
- Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
- Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
- Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
- Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
- Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
- Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
- Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
- Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
- Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
- Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
- Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
- Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
- Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
- Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
- Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
- Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
- Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
- Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
- Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
- Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
- Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
- Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer’s patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
- Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
- Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
- Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
- Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
- Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
- Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
- Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
- Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
- Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
- Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
