Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori
Summary
Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d’uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l’utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.
Abstract
Uscita del leucocita dai tessuti periferici ai linfonodi drenanti non è solo fondamentale per la sorveglianza immune e l’inizio, ma contribuisce anche alla risoluzione delle risposte dei tessuti periferici. Mentre una varietà di metodi sono usati per quantificare in uscita del leucocita dai tessuti non linfoidi, periferici, i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il contesto-dipendente in uscita rimangono poco compresi. Qui, descriviamo l’uso di fotoconversione in situ per l’analisi quantitativa di uscita del leucocita da murina pelle e tumori. Fotoconversione permette l’etichettatura diretta dei leucociti residente all’interno del tessuto cutaneo. Anche se l’esposizione della pelle a luce ultravioletta induce locale le risposte infiammatorie caratterizzano da infiltrati del leucocita e permeabilità vascolare, in un confronto testa a testa con applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, fotoconversione specificamente con etichetta popolazioni migratori delle cellule dendritiche e contemporaneamente abilitato la quantificazione di uscita mieloide e linfoidi da microambienti cutanei e tumori. I meccanismi d’uscita del leucocita rimangono un componente mancante nella nostra comprensione della complessità del leucocita intratumoral, e così l’applicazione degli strumenti descritti nel presente documento fornirà visione unica le dinamiche del tumore immuni microambienti entrambi a costante dichiari e in risposta alla terapia.
Introduction
Risposte immunitarie tessuto periferico sono a forma di non solo di reclutamento leucocitario ai siti di infiammazione, ma anche dai meccanismi che regolano la loro successiva conservazione. Così, l’immunità protettiva è dettata dalla cumulativi meccanismi cellulari e molecolari che determinano se un leucocita entra, soggiorni all’interno, o meglio migra dal tessuto periferico tramite vasi linfatici. D’importanza, la propensione per i leucociti uscire del tessuto attraverso i vasi linfatici (definito in uscita) è legata alla loro funzioni specializzate. Le cellule dendritiche (DC) acquisiscono comportamento migratore in risposta a segnali di maturazione che conduce al trasporto dell’antigene e presentazione nello scarico dei linfonodi (dLN), un processo che è necessario per l’immunità adattativa1. Lo scavenging cellule mieloidi, quali macrofagi e neutrofili, servono a rimuovere i detriti apoptotici attraverso fagocitosi. Durante l’infezione batterica, neutrofili uscita del tessuto e, infine, andare incontro ad apoptosi in dLNs2 e in un modello di colite DSS indotta, dati supportano l’ipotesi che l’uscita del macrofago è necessaria per risolvere l’infiammazione locale3. Tuttavia, se conta dei neutrofili e dei macrofagi in uscita si verifica in tutti i contesti infiammatori, è sconosciuto. Prove per l’uscita dei linfociti T da stazionario4,5,6,7, infetti8e infiammata4,9,10, 11,12 tessuti periferici non linfoidi indica che le cellule T ricircolare attivamente, anche se i segnali tissutali che guidano questa uscita rimangono poco compresi. Parecchi studi hanno identificato i segnali necessari per la migrazione direzionale verso lo scarico di capillari linfatici e successivi uscita compreso ligando di chemochina (motivo C-C) 21 (CCL21) e del suo recettore CCR74,11, 13, ligando di chemochina (motivo C-X-C) 12 (CXCL12) e il suo recettore CXCR42,14e sfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Questi meccanismi non sono attivi in tutti i contesti, tuttavia, e se essi determinano in uscita di tutti i tipi di cellule rimane una questione aperta. D’importanza, ulteriore comprensione dei meccanismi che regolano l’uscita e la sua rilevanza funzionale nella malattia richiede metodi quantitativi in vivo di analisi.
Diversi metodi sono stati usati per quantificare in uscita in più modelli animali in vivo , tra cui diretto incannulazione dei vasi linfatici, trasferimento adottivo di ex vivo etichettato leucociti, applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, iniezione di particelle con etichettate e in vivo fotoconversione17,18. Incannulazione diretta dei vasi linfatici afferenti del mouse è difficile e limitata nei piccoli animali dai volumi di liquido che può essere raccolto. Così, inserimento di una canula in gran parte è stata eseguita in animali di grandi dimensioni (ad es., pecore) dove tali manipolazioni chirurgiche sono pratici. Questi studi forniscono la prova diretta per la presenza di cellule mieloidi e linfoidi in linfa10,19,20. Inoltre, ovine modelli rivelano che l’infiammazione acuta e cronica aumentata presenza dei linfociti nei linfonodi da quasi 100 volte10,21.
Trasferimento adottivo di linfociti con etichettati e geneticamente manipolati soprattutto ha rivelato che CCR7 è necessaria per l’uscita di CD4+ T cellule da acutamente inflamed pelle5,11, mentre il pretrattamento dei linfociti con la piccola molecola agonista del recettore S1P, FTY720, inibisce solo parzialmente la loro uscita10. È interessante notare che, l’uscita dei linfociti trasferiti da pelle cronicamente infiammata è CCR7-indipendente10, ma parzialmente può richiedere CXCR49. Esperimenti di trasferimento adottivo, tuttavia, forniscono numeri non-fisiologica di ex vivo linfociti attivati ed etichettati nel tessuto attraverso l’iniezione, che altera l’ambiente biomeccanica dei tessuti e l’elevata pressione del fluido interstiziale che aprire capillari linfatici iniziali e alterare le loro proprietà di trasporto22. Come un’applicazione alternativa, transdermica di isotiocianato di fluorescina (FITC) in presenza o assenza di sostanze irritanti cutanei (ad es., dibutilftalato, DBP) o infezione23,24 consente per il tracciamento degli cellule fagocitiche che si accumulano tracciante e la migrazione a dLNs. Analogamente, fluorescente identificati tumori forniscono un mezzo per tenere traccia di cellule fagocitiche che hanno inghiottito tumore materiale25. Questi metodi hanno fornito la comprensione importante nei meccanismi che regolano DC uscita13,14,17,26,27 , ma sono in grado di tenere traccia non fagocitica linfociti e, interpretazione può essere complicate da libero drenaggio linfatico di FITC solubile così etichettatura stanziali, LN residente DCs.
In alternativa, la microscopia intravital è un potente strumento che permette per il monitoraggio in vivo di popolazioni leucocitarie fisiologicamente rilevanti in tempo reale28,29. Usato in combinazione con i topi reporter e base di anticorpi in vivo etichettatura immunofluorescente, videomicroscopia microscopia ha rivelato il complesso spaziale e dinamica temporale di immune cellula traffico, tra cui migrazione interstiziale30 , trasmigrazione attraverso l’endotelio linfatico, il passaggio all’interno del lume linfatico e migrazione su LN voce28,31. L’adozione di tecniche di imaging videomicroscopia è limitata dalla spesa, competenze necessarie per la messa a punto e limitata velocità di trasmissione per quantificare più tipi di cellule. Ancora, metodi quantitativi che analizzare le dinamiche di popolazione di accoppiamento tessuti con imaging videomicroscopia fornirà ulteriori e importanti informazioni per quanto riguarda i meccanismi di migrazione verso e all’interno di capillari linfatici e motilità 18 , 31 , 32.
Di conseguenza, in vivo fotoconversione è emerso come un metodo che consente di in situ di etichettatura, indipendente di attività fagocitaria e per la quantificazione di uscita fisiologico del leucocita (quando accoppiato con citometria a flusso) nella assenza o presenza di sfida. Topi di Kaede-Tg esprimono costitutivamente una proteina isolata dal corallo che presenta fluorescenza verde (Kaede verde) fino a quando esposto a luce ultravioletta, dopo di che irreversibilmente converte in fluorescenza rossa (Kaede rosso)33. Photoconverted cellule possono essere monitorate come essi uscire da luoghi periferici del tessuto e si accumulano nel dLNs. Questo e altri simili fotoconvertibile mouse modelli34,35 hanno rivelato biologia importante tra cui uscita costitutiva delle cellule T regolatorie da pelle36, servizi esterni di CXCR4-dipendente delle cellule di B da placche di Peyer37 , mobilizzazione delle cellule di T di memoria residente al momento del peptide ri-sfida38e l’uscita del leucocita ampio da tumore microambienti39. Nel presente documento, eseguiamo un confronto testa a testa di fotoconversione con applicazione transdermica FITC nel contesto di infiammazione cutanea e infezione per consentire un confronto diretto dei dati esistenti con il metodo fotoconvertibile. Inoltre, dimostriamo fotoconversione in tumori impiantati e descrivere l’efficienza di conversione e l’uscita selettiva da microambienti di tumore. Come tale, ci sostengono che ulteriore applicazione di questi metodi è necessario chiarire la biologia critica d’uscita del leucocita dai tumori, che avrà implicazioni significative per l’interpretazione delle complessità di intratumoral del leucocita, immunità anti-tumorale, e risposta alla terapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se l’uscita del leucocita dai tessuti periferici, non linfoidi è critico per l’avvio e la risoluzione della risposta immunitaria, i meccanismi molecolari che regolano i servizi esterni sono capiti male. Questa lacuna nella conoscenza è in gran parte a causa della pronta disponibilità di strumenti per la quantificazione in vivo. Qui, descriviamo l’uso di topi fotoconvertibile (Kaede-Tg) a quantificare egress endogeno del leucocita dalla pelle e tumori e fornire un diretto confronto testa a testa con vern…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Marcus Bosenberg per la fornitura di YUMM 1.1 e linee di melanoma murino YUMM 1.7 e Dr. Deborah J. Fowell per la fornitura di B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr topi in accordo con RIKEN BRC attraverso la Bio-risorsa nazionale di MEXT, Giappone.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
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