Murine त्वचा और ट्यूमर से लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ल्युकोसैट निकास बढ़ाता
Summary
यहां, हम ल्युकोसैट निकास के vivo ठहराव में भोले, सूजन, और घातक murine त्वचा के लिए तरीके प्रदर्शित करते हैं । हम दो मॉडलों की एक सिर से सिर की तुलना प्रदर्शन: ट्रांसडर्मल FITC आवेदन और सीटू photoconversion में । इसके अलावा, हम त्वचा के ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास पर नज़र रखने के लिए photoconversion की उपयोगिता का प्रदर्शन ।
Abstract
परिधीय ऊतकों से ल्युकोसैट निकास लिम्फ नोड्स draining के लिए न केवल प्रतिरक्षा निगरानी और दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी परिधीय ऊतक प्रतिक्रियाओं के समाधान के लिए योगदान देता है । जबकि तरीकों की एक किस्म के लिए गैर लसीकावत्, परिधीय ऊतकों, सेलुलर और आणविक तंत्र है कि संदर्भ पर शासन-निर्भर निकास खराब समझ में रहने से ल्युकोसैट निकास यों तो इस्तेमाल किया जाता है । यहां, हम murine त्वचा और ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सीटू photoconversion में उपयोग का वर्णन । Photoconversion चमड़े के नीचे ऊतक के भीतर ल्यूकोसाइट्स निवासी के प्रत्यक्ष लेबलिंग के लिए अनुमति देता है । हालांकि बैंगनी प्रकाश के लिए त्वचा जोखिम स्थानीय भड़काऊ ल्युकोसैट घुसपैठ और संवहनी leakiness द्वारा विशेषता प्रतिक्रियाओं लाती है, एक सिर में फ्लोरोसेंट अनुरेखकों के ट्रांसडर्मल आवेदन के साथ तुलना सिर, photoconversion विशेष रूप से लेबल प्रवासी वृक्ष कोशिका आबादी और इसके साथ ही त्वचा के microenvironments और ट्यूमर से माइलॉयड और लसीकावत् निकास के ठहराव सक्षम होना चाहिए । ल्युकोसैट निकास के तंत्र intratumoral ल्युकोसैट जटिलता के बारे में हमारी समझ में एक लापता घटक रहते हैं, और इस प्रकार के उपकरण के आवेदन के साथ साथ यहां वर्णित ट्यूमर प्रतिरक्षा की गतिशीलता में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा microenvironments दोनों स्थिर राज्य में और चिकित्सा के जवाब में ।
Introduction
परिधीय ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं न केवल सूजन की साइटों के लिए ल्युकोसैट भर्ती द्वारा आकार के हैं, लेकिन यह भी तंत्र है कि उनके बाद प्रतिधारण को विनियमित द्वारा । इस प्रकार, सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा संचई सेलुलर और आणविक तंत्र है कि निर्धारित करता है कि एक ल्युकोसैट में प्रवेश करती है, भीतर रहता है, या नहीं बल्कि लसीका वाहिकाओं के माध्यम से परिधीय ऊतक के बाहर प्रवास द्वारा तय है । महत्वपूर्ण बात, ल्यूकोसाइट्स के लिए प्रवृत्ति लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ऊतक बाहर निकलने के लिए (निकास) उनके विशेष कार्यों से जुड़ा हुआ है । वृक्ष कक्ष (DC) में परिपक्वता संकेत antigen परिवहन और प्रस्तुति में लिम्फ नोड्स (dLN), एक प्रक्रिया है कि अनुकूली उन्मुक्ति प्रतिरक्षा के लिए आवश्यक है के लिए अग्रणी की प्रतिक्रिया में प्रवासी व्यवहार प्राप्त1। ऐसी मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के रूप में माइलॉयड कोशिकाओं सफाई, phagocytosis के माध्यम से अपोप्तोटिक मलबे स्पष्ट करने के लिए सेवा करते हैं । बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान, न्यूट्रोफिल निकास ऊतक और अंत में dLNs2 में apoptosis से गुजरना और DSS-प्रेरित कोलाइटिस के एक मॉडल में, डेटा परिकल्पना है कि मैक्रोफेज निकास स्थानीय सूजन3को हल करने के लिए आवश्यक है का समर्थन करता है । चाहे न्युट्रोफिल और मैक्रोफेज निकास सभी भड़काऊ संदर्भों में होता है, तथापि, अज्ञात है । टीलिम्फोसाइट निकास स्थिर राज्य से4,5,6,7, संक्रमित8, और सूजन4,9,10, के लिए सबूत 11,12 परिधीय, गैर लसीकावत् ऊतकों को इंगित करता है कि टी कोशिकाओं को सक्रिय रूप से पुनर्संचारित, हालांकि ऊतक आधारित संकेतों है कि इस बाहर निकलें ड्राइव खराब समझ में रहते हैं । कई अध्ययनों से पहचाना लसीका केशिकाओं और बाद में निकास सहित chemokine (सी सी आकृति) ligand 21 (CCL21) और इसकी रिसेप्टर CCR74,11draining की ओर दिशात्मक प्रवास के लिए आवश्यक संकेतों की पहचान की है 13, chemokine (सी-एक्स-सी आकृति) ligand 12 (CXCL12) और इसकी रिसेप्टर CXCR42,14, और sphingosine-1-फॉस्फेट (S1P)10,15,16. इन तंत्रों सभी संदर्भों में सक्रिय नहीं हैं, तथापि, और क्या वे सभी प्रकार के सेल के निकास निर्धारित एक खुला सवाल रहता है । महत्वपूर्ण बात, तंत्र में और अधिक जानकारी है कि निकास और उसकी बीमारी में कार्यात्मक प्रासंगिकता नियंत्रण के विश्लेषण के vivo तरीकों में मात्रात्मक की आवश्यकता है ।
कई तरीकों को लसीका वाहिकाओं के प्रत्यक्ष cannulation सहित vivo में कई पशु मॉडलों में निकास यों तो इस्तेमाल किया गया है, पूर्व वीवो लेबल ल्यूकोसाइट्स, फ्लोरोसेंट अनुरेखक के ट्रांसडर्मल आवेदन के दत्तक हस्तांतरण, लेबल कणों के इंजेक्शन, और vivo photoconversion में17,18. प्रत्यक्ष cannulation के afferent माउस लसीका वाहिकाओं मुश्किल है और तरल पदार्थ है कि एकत्र किया जा सकता है की मात्रा से छोटे जानवरों में सीमित है । इस प्रकार, cannulation मोटे तौर पर बड़े जानवरों में प्रदर्शन किया गया है (जैसे, भेड़) जहां इस तरह के सर्जिकल जोड़तोड़ व्यावहारिक हैं । ये अध्ययन दोनों लसीकावत् और माइलॉयड कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए प्रत्यक्ष सबूत10,19,20में प्रदान करते हैं । इसके अलावा, ovine मॉडल पता चलता है कि तीव्र और जीर्ण सूजन लिम्फ में लिम्फोसाइट उपस्थिति में वृद्धि हुई लगभग १००-गुना10,21.
लेबल और आनुवंशिक रूप से हेरफेर लिम्फोसाइटों के दत्तक स्थानांतरण महत्वपूर्ण रूप से पता चला है कि CCR7 तीव्र सूजन त्वचा से CD4+ टी कोशिकाओं के निकास के लिए आवश्यक है5,11, जबकि लिम्फोसाइटों के उपचार छोटे अणु S1P रिसेप्टर एगोनिस्ट, FTY720 के साथ, केवल आंशिक रूप से उनके10निकास को रोकता है । दिलचस्प है, लंबे समय से सूजन त्वचा से तबादला लिम्फोसाइटों के निकास CCR7-स्वतंत्र10है, लेकिन आंशिक रूप से9CXCR4 की आवश्यकता हो सकती है । adoption स्थानांतरण प्रयोगों, तथापि, गैर शारीरिक संख्या में सक्रिय पूर्व vivo और इंजेक्शन के माध्यम से ऊतक में लिम्फोसाइटों लेबल, जो ऊतकों और ऊंचा मध्यवर्ती द्रव दबाव के यांत्रिक वातावरण बदल वितरित कि प्रारंभिक लसीका केशिकाओं खुला और उनके परिवहन गुण22बदल जाते हैं । एक विकल्प के रूप में, fluorescein isothiocyanate (FITC) की उपस्थिति या चमड़े की अड़चन के अभाव में ट्रांसडर्मल आवेदन (जैसे, dibutyl phthalate, DBP) या23संक्रमण,24 की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है phagocytic कोशिकाओं है कि अनुरेखक जमा और dLNs के लिए माइग्रेट. इसी तरह, फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर phagocytic कोशिकाओं है कि ट्यूमर सामग्री25घिरा हुआ है ट्रैक करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं । इन पद्धतियों तंत्र है किडीसी निकास13,14,17,26,27 पर शासन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, लेकिन गैर phagocytic ट्रैक करने में असमर्थ है लिम्फोसाइटों और, व्याख्या मुक्त घुलनशील FITC के लसीका जल निकासी इस प्रकार गैर प्रवासी, LN निवासी dc लेबल द्वारा जटिल हो सकता है ।
वैकल्पिक रूप से, intravital माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण है कि vivo वास्तविक समय28,29में शारीरिक रूप से प्रासंगिक ल्युकोसैट आबादी के ट्रैकिंग में के लिए अनुमति देता है । रिपोर्टर चूहों और एंटीबॉडी-vivo immunofluorescent लेबलिंग में आधारित के साथ संयोजन में प्रयुक्त, intravital माइक्रोस्कोपी मध्य प्रवास 30 सहित प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी के जटिल स्थानिक और लौकिक गतिशीलता से पता चला है , लसीका endothelium भर में स्थानांतरगमन, लसीका लुमेन के भीतर पारित होने और, LN प्रविष्टि28,31पर प्रवासन । intravital इमेजिंग तकनीक के व्यापक अपनाने व्यय द्वारा सीमित है, सेट अप के लिए आवश्यक विशेषज्ञता, और एकाधिक कोशिका प्रकार को बढ़ाता है के लिए सीमित प्रवाह । फिर भी, युग्मन मात्रात्मक विधियों कि intravital इमेजिंग के साथ जनसंख्या गतिशीलता ऊतकों का विश्लेषण गतिशीलता और प्रवास की ओर और लसीका केशिकाओं के भीतर के तंत्र के संबंध में अतिरिक्त और महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा 18 , 31 , ३२.
नतीजतन, vivo photoconversion में एक तरीका है कि सीटू लेबलिंग में , phagocytic गतिविधि से स्वतंत्र के लिए अनुमति देता है के रूप में उभरा है, और शारीरिक ल्युकोसैट निकास के ठहराव के लिए (जब प्रवाह cytometry के साथ युग्मित) में अनुपस्थिति या चुनौती की उपस्थिति । Kaede-टीजी चूहों constitutively पथरीले कोरल है कि हरी प्रतिदीप्ति (Kaede हरा) से अलग बैंगनी प्रकाश को उजागर जब तक प्रदर्शित एक प्रोटीन व्यक्त, जिसके बाद यह अचल लाल प्रतिदीप्ति (Kaede लाल)३३में धर्मांतरित । Photoconverted कोशिकाओं के रूप में वे परिधीय ऊतक साइटों से निकास और dLNs में जमा ट्रैक किया जा सकता है । यह और इसी तरह के अंय photoconvertible माउस मॉडल३४,३५ से पता चला है महत्वपूर्ण जीव विज्ञान के गठन निकास सहित त्वचा से विनियामक टी कोशिकाओं३६, CXCR4-निर्भर बी सेल निकास से Peyer पैच३७ , पर निवासी स्मृति टी कोशिकाओं के जुड़ाव पेप्टाइड पुनः चुनौती३८, और व्यापक ल्युकोसैट निकास ट्यूमर microenvironments३९से । इस के साथ साथ, हम त्वचा की सूजन और संक्रमण के संदर्भ में ट्रांसडर्मल FITC आवेदन के साथ photoconversion की एक सिर से सिर की तुलना करने के लिए photoconvertible विधि के साथ मौजूदा डेटा की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम प्रत्यारोपित ट्यूमर में photoconversion प्रदर्शन और ट्यूमर microenvironments से रूपांतरण दक्षता और चयनात्मक निकास का वर्णन । जैसे, हम तर्क है कि इन तरीकों के आगे आवेदन के लिए ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास के महत्वपूर्ण जीव विज्ञान स्पष्ट की जरूरत है, जो intratumoral ल्युकोसैट जटिलता की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ होगा, विरोधी ट्यूमर उन्मुक्ति, और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि परिधीय से ल्युकोसैट निकास, गैर लसीकावत् ऊतकों दीक्षा और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के समाधान के लिए महत्वपूर्ण है, आणविक तंत्र है कि सरकार निकास खराब समझ रहे हैं । ज्ञान में यह अंतर काफी हद तक v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक YUMM १.१ और YUMM १.७ murine मेलेनोमा लाइनों और डॉ दबोरा जे Fowell प्रदान करने के लिए बी-6 प्रदान करने के लिए डॉ मार्कस Bosenberg शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । तटरक्षक-टीजी (सीएजी-tdKaede) MEXT, जापान के राष्ट्रीय जैव संसाधन के माध्यम से आरआईकेईएन BRC के साथ समझौते में चूहों 15Utr ।
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
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