लागू करने में उन्नत इन विट्रो संवर्धन प्रौद्योगिकी मानव आंत का अध्ययन करने के लिए Microbiota
Summary
यहां, हम संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान इन विट्रो में पेट microbiota की एक श्रृंखला का उपयोग कर, कि गैस्ट्रो आंत्र पथ की शारीरिक स्थितियों अनुकरण ।
Abstract
मानव आंत microbiota मानव स्वास्थ्य और रोग दोनों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । microbiota आंत का अध्ययन vivo मॉडल में एक का उपयोग कर, अपने जटिल प्रकृति के कारण मुश्किल है, और स्तनधारी घटकों के साथ अपने विविध संघ । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है संस्कृति के लिए इन विट्रो में आंत microbiota, जो आंत microbiota गतिशीलता के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, बिना स्तनधारी वातावरण के योगदान पर विचार करने के लिए. इन विट्रो संवर्धन प्रौद्योगिकी में उपयोग करना, गैस्ट्रो आंत्र पथ की शारीरिक स्थितियों जैसे पीएच, तापमान, anaerobiosis, और पारगमन समय के रूप में मानकों सहित अनुकरणीय हैं । बृहदांत्र की आंतों की सतह mucin-लेपित वाहकों को जोड़ने, एक श्लैष्मिक चरण बनाने, और आगे आयाम जोड़ने के द्वारा नकली है । आंत microbiota मानव मल सामग्री के साथ inoculating द्वारा शुरू की है । बैक्टीरिया के इस जटिल मिश्रण के साथ टीका पर, विशिष्ट रोगाणुओं अलग अनुदैर्ध्य में समृद्ध कर रहे है (आरोही, अनुप्रस्थ और उतरते कालोनियों) और आड़ा (चमकदार और श्लैष्मिक) इन विट्रो मॉडल के वातावरण । यह प्रणाली एक स्थिर राज्य है, जिसमें समुदाय और चयापचयों उत्पादन स्थिर रहने तक पहुंचने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है । इस पांडुलिपि में प्रयोगात्मक परिणाम प्रदर्शन कैसे inoculated आंत microbiota समुदाय समय के साथ एक स्थिर समुदाय में विकसित करता है । एक बार स्थिर राज्य हासिल की है, प्रणाली के लिए बैक्टीरियल बातचीत और सामुदायिक कार्यों का विश्लेषण या आंत microbiota पर किसी भी additives के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसे भोजन, भोजन के घटकों, या फार्मास्यूटिकल्स के रूप में ।
Introduction
आंत microbiota सूक्ष्म जीवों कि मानव जठरांत्र पथ (GIT) में रहते है की एक समुदाय है । इस समुदाय के बृहदांत्र में अधिकतम एकाग्रता है, जो 1013-1014 बैक्टीरिया पकड़ से 500-1000 प्रजातियों, कि बृहदांत्र वातावरण1,2के साथ सहजीवन में रहने का अनुमान है तक पहुंचता है । संयोजन और आंत microbiota की कार्यक्षमता GIT के साथ स्थानिक परिवर्तन, क्षेत्र विशिष्ट समुदायों के गठन, सबसे अधिक विविधता के साथ पाया गया लंबा2,3,4,5। प्रत्येक संरचनात्मक क्षेत्र के लिए, अलग माइक्रोबियल समुदायों लुमेन में और श्लैष्मिक अस्तर6पर रहते हैं । लुमेन समुदाय पोषक तत्वों के लिए और अधिक सीधी पहुंच है के रूप में सब्सट्रेट चमकीले डिब्बे7के माध्यम से चलते हैं । इस के बावजूद, कुछ बैक्टीरिया तरजीही बलगम परत में रहते हैं, एक ऊर्जा स्रोत1,5,8के रूप में बृहदांत्र कोशिकाओं द्वारा उत्पादित mucin का उपयोग । चमकदार और श्लैष्मिक चरणों के बीच microenvironments में अंतर फर्क में परिणाम और चरण विशिष्ट समुदायों के विकास । साथ में, इन समुदायों को चयापचय कार्यों प्रदान करते हैं, जैसे पोषक तत्व चयापचय और विटामिन के उत्पादन, और प्रतिरक्षा कार्यों, मानव रोगजनकों के औपनिवेशीकरण को रोकने के रूप में1,3, 9. आंत microbiota भी मानव बृहदांत्र3कोशिकाओं के साथ विकार में कार्यात्मक काम करता है ।
मानव GIT का एक महत्वपूर्ण भाग के रूप में, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि आंत microbiota दोनों मेजबान स्वास्थ्य और रोग स्थिति3,9,10,11,12में योगदान करने के लिए जाना जाता है । आंत माइक्रोबियल आबादी में बदलाव आंत्र आंत्र रोग (आईबीडी) और आंत्र आंत्र सिंड्रोम (आईबीएस) जैसे GIT विकारों सहित कई मानव रोगों, के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन यह भी मोटापे के रूप में अंय रोगों, संचार रोग, और आत्मकेंद्रित 3 , 9 , 10 , 11 , 12. चयापचयों आंत microbiota से उत्पादित एक वैश्विक प्रभाव है, दूर आंत12,13से स्थानों तक पहुंचने । उदाहरण के लिए, पेट मस्तिष्क धुरी चिंता और अवसाद की तरह मानसिक विकारों के साथ जुड़ा हुआ है14। इसलिए, आंत microbiota अध्ययन के अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण है, और कई रोगों के लिए लागू है, यहां तक कि उन अक्सर GIT के साथ जुड़े नहीं ।
हालांकि यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि अध्ययन आंत microbiota महत्वपूर्ण है, यह एक जटिल प्रयास है । कई पशु मॉडल बंदरों और सूअरों की तरह बड़े लोगों के लिए, zebrafish, चूहों, और चूहों की तरह छोटे जानवरों से, उपलब्ध हैं15-19। हालांकि, मानव आंत microbiota के संदर्भ में इन जानवरों के आवेदन सीधा नहीं है, क्योंकि इन जानवरों पर्यावरण और आहार के आधार पर विकसित किया गया है कि एक अद्वितीय जीवाणु समुदाय है, और वे20 मनुष्यों से अलग anatomically हैं , 21. मानव विषयों के उपयोग प्रासंगिकता के सवाल को हटा अभी तक चुनौतियों का एक और सेट का परिचय । मानव अध्ययन महंगा है, समय लगता है, और नैतिक रूप से11विवश कर रहे हैं । इसके अलावा, पाया कारकों मानव अध्ययन में आंत microbiota प्रभाव, उंर या विकास के चरण, पर्यावरण, आहार, दवा सहित, और आनुवंशिक कारकों2,4,22। वहां भी क्या मनुष्यों में परीक्षण किया जा सकता है पर प्रतिबंध हैं, और नमूनों की किस प्रकार4बार में काटा जा सकता है ।
एक में vivo प्रणाली का उपयोग करने आंत microbiota अध्ययन के एक महत्वपूर्ण नुकसान स्तनधारी घटकों की उपस्थिति है । आंत microbiota और मानव कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ बातचीत, और में एक vivo सेटिंग में, यह असंभव है दोनों को अलग करने के लिए । आंत microbiota द्वारा उत्पादित चयापचयों में बृहदांत्र कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, तो माप परिशुद्धता के साथ गणना नहीं की जा सकती । इसलिए, किसी भी यंत्रवत अध्ययन अंत बिंदु माप11तक ही सीमित होना चाहिए । vivo अध्ययन में के लिए एक अंय प्रमुख नुकसान GIT longitudinally23के विभिंन क्षेत्रों से नमूने फसल के लिए अक्षमता है । यह समय12पर कोलन के microenvironments में हो सकने वाले परिवर्तनों के आकलन के लिए अनुमति नहीं देता है । vivo अध्ययन में कई मानव अध्ययन सहित, पेट microbiota12में परिवर्तन का पता लगाने के लिए मल के नमूनों के विश्लेषण पर निर्भर करते हैं । हालांकि यह जानकारीपूर्ण है, यह GIT भर आंत microbiota पर डेटा प्रदान नहीं करता है और चमकदार और श्लैष्मिक समुदायों के बीच अंतर नहीं करता है5,6,7,8।
आंत microbiota के लिए, एक इन विट्रो विधि के आवेदन स्तनधारी घटकों से हस्तक्षेप के बिना, बैक्टीरियल समुदाय की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । का उपयोग करते हुए इन विट्रो विधि पर्यावरण की स्थिति10के तंग नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, एक साथ कई मापदंडों का परीक्षण, और longitudinally नमूना करने की क्षमता, और बड़ी मात्रा में11. चूंकि इन विट्रो विधि एक यांत्रिक उपकरण और नहीं एक मेजबान का उपयोग करता है, कोई विचार उंर, पर्यावरण, आहार, या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए आवश्यक हैं । इन प्रणालियों के लिए या तो पूरे आंत microbiota समुदाय, केवल चयनित जीवों, या यहां तक कि एक उपभेदों परीक्षण किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, इन विट्रो परिणामों में reproducible हैं, अभी तक vivo अध्ययन11,22में तुलनीय विविधता के स्तर को बनाए रखने ।
सवाल में परिकल्पना और वांछित परिणाम पर निर्भर करता है, मैंn विट्रो अध्ययन कई मायनों में किया जा सकता है । वे एकल पोत प्रणालियों और ऐसे मल homogenate24 के साथ नमूनों की मशीन के रूप में सरल तरीकों, का उपयोग कर सकते है या 24-48 एच25के पाठ्यक्रम पर एकल बैच संस्कृतियों प्रदर्शन । वे भी एकल पोत प्रणालियों और अधिक जटिल तरीकों का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है, जैसे एक chemostat प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक स्थिर आंत माइक्रोबियल समुदाय11का उत्पादन । हालांकि, एक रिएक्टर का उपयोग खत्म कर सकते है microbiota12 सरल क्योंकि यह केवल बृहदांत्र के एक खंड का प्रतिनिधित्व करता है, भले ही बृहदांत्र आरोही, अनुप्रस्थ, और उतरते क्षेत्रों से बना है ।
आदेश में आंत microbiota समुदाय है कि बृहदांत्र के विभिंन क्षेत्रों में विकसित का अध्ययन करने के लिए (आरोही, अनुप्रस्थ, और उतरते क्षेत्रों), एक जटिल, बहु मंच प्रणाली कार्यरत किया जा सकता है । इन प्रणालियों में, एकाधिक जहाजों की स्थापना के लिए बृहदांत्र के विभिंन क्षेत्रों की नकल कर रहे हैं, तो आरोही, अनुप्रस्थ, और उतरते क्षेत्रों के आंत microbiota स्वतंत्र रूप से खेती कर रहे हैं । इन जहाजों से जुड़े हुए हैं, पंपों का उपयोग करने के क्रम में सब्सट्रेट कदम, आरोही से अनुप्रस्थ के लिए उतरते बृहदांत्र क्षेत्रों के लिए, GIT के माध्यम से पोषक तत्वों का प्रवाह नकल उतार ।
इस अध्ययन का उद्देश्य कैसे एक 5 इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में मंच ( सामग्री की तालिकादेखें) को आंत microbiota समुदाय खेती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और स्थिरता और संरचना के मामले में समुदाय गतिशीलता को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था । इस प्रणाली में, एक पोत पेट का प्रतिनिधित्व करता है और एक छोटी आंत का प्रतिनिधित्व करते हैं । बृहदांत्र तीन क्षेत्रों में विभाजित है (आरोही, अनुप्रस्थ, उतरते), एक प्रत्येक क्षेत्र26का प्रतिनिधित्व पोत के साथ । इस प्रायोगिक सेटअप में, दो पूरा सिस्टम समानांतर में चला रहे थे, 1 इकाई mucin वाहक युक्त के साथ श्लैष्मिक सतह और कोई mucin वाहक युक्त 2 यूनिट का प्रतिनिधित्व करता है । समुदाय है कि प्रत्येक क्षेत्र के चमकदार और श्लैष्मिक चरणों में विकसित एक दूसरे की तुलना में थे, और मल इनोक्युलम के लिए समय पर 16S rRNA जीन अनुक्रमण और SCFA विश्लेषण का उपयोग कर । प्रस्तुत परिणामों के समुदाय के प्रकार, दोनों संरचना और कार्यक्षमता है, जो इन विट्रो प्रणाली में इस प्रकार से उत्पादित किया जा सकता है के मामले में प्रदर्शन किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो संवर्धन प्रणालियों में बड़ी आंत के आंत microbiota अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । वे गैस्ट्रो आंत्र पथ की शारीरिक स्थिति अनुकरण डिजाइन उपकरण का उपयोग करें,३३बृहदांत्र के प्रत्येक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सुश्री ऑड्रे थॉमस-Gahring उसे जीसी/ms काम के लिए स्वीकार किया है । हम भी पांडुलिपि संपादन के लिए मास्सिमो Marzorati शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
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