Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro
Summary
Burada, fizyolojik şartlarda mide bağırsak, taklit Biyoreaktörler bir dizi kullanarak gut microbiota kolon tüp bebek, kültür için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
İnsan gut microbiota insan sağlığı ve hastalıkları önemli bir rol oynar. Vivo modelini kullanarak gut microbiota okuyan, karmaşık doğası ve memeli bileşenleri ile çeşitli dernek nedeniyle zordur. Bu iletişim kuralı memeli ortamın katkısını düşünün zorunda kalmadan gut microbiota dinamikleri, çalışma için sağlayan gut microbiota in vitro kültür için hedeftir. Vitro kültür teknoloji kullanarak, fizyolojik şartlarda, mide bağırsak, pH, sıcaklık, anaerobiosis ve geçiş süresi gibi parametreleri de dahil olmak üzere simüle. Kolon bağırsak yüzeyini müsin kaplı taşıyıcıları ekleme, mukozal faz oluşturma ve daha fazla boyut ekleme simüle. Gut microbiota insan dışkı malzeme ile aşı kullanılmaya başlandı. Bakteri karmaşık bu karışımı ile aşı farklı boyuna (artan düzende, enine ve azalan iki nokta üst üste) belirli mikroplar zenginleştirilmiş ve tüp bebek modeli enine (luminal ve mukozal) ortamlar. Bu sistemin içinde topluluk ve üretilen metabolitleri stabil bir kararlı duruma ulaşmak izin vermek önemlidir. Bu el yazması deneysel sonuçlar nasıl aşısını gut microbiota topluluk kararlı bir toplum içine zaman içinde gelişir göstermektedir. Kararlı duruma elde bir kez, sistem bakteriyel etkileşimleri ve topluluk işlevlerine çözümlemek veya gut microbiota, gıda, gıda bileşenleri veya ilaç gibi herhangi bir katkı maddesi etkilerini test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Gut microbiota insan gastrointestinal sistem (GIT) bulunan mikroorganizmalar bir topluluktur. Bu topluluk kolon, kolon ortamın1,2ile sembiyoz yaşayan 500-1000 türlerden 1013-1014 bakteri tutmak için tahmini maksimum konsantrasyon ulaşır. Kompozisyon ve gut microbiota işlevselliğini sokumunun2,3,4,5buldum çoğu çeşitliliği ile bölge özel topluluklar, şekillendirme GIT boyunca dağınık şekilde değiştirin. Anatomik her bölge için ayrı mikrobiyal topluluklar lümen ve mukozal astar6bulunur. Gibi yüzeylerde luminal yuvası7arası hareket lümen Topluluk besin daha doğrudan erişimi vardır. Buna rağmen bazı bakteriler tercihen bir enerji kaynağı1,5,8olarak iki nokta üst üste hücreleri tarafından üretilen müsin kullanan mukus katmanda yer alır. Microenvironments farkı luminal ve mukozal aşamalar arasına sapma ve geliştirme aşamasında belirli topluluklar ile sonuçlanır. Birlikte, bu toplulukların besin metabolizma ve vitaminler, üretim gibi metabolik fonksiyonları ve insan patojenleri1,3, kolonizasyon engellemek gibi immünolojik fonksiyonları sağlar 9. gut microbiota aynı zamanda işlevsel olarak konjugasyon insan kolon hücreleri3ile çalışır.
İnsan GIT önemli bir parçası gut microbiota her iki ana sağlık ve hastalık durumu3,9,10,11,12‘ ye katkıda bilinmektedir şaşırtıcı değil. Bağırsak mikrobiyal nüfus bir kayma gibi bağırsak bağırsak hastalığı (IBD) ve bağırsak bağırsak sendromu (IBS), aynı zamanda diğer hastalıkları, obezite, dolaşım hastalık ve Otizm gibi GIT bozukluklar da dahil olmak üzere birden çok insan hastalıkları ile ilişkili olduğu düşünülmektedir 3 , 9 , 10 , 11 , 12. gut microbiota üretilen metabolitleri gut12,13uzak mekanlar ulaşan bir küresel etkiye sahip. Örneğin, gut-beyin eksen14anksiyete ve depresyon gibi ruhsal bozukluklar ile ilişkilidir. Bu nedenle, gut microbiota eğitim araştırma birden çok alan için önemlidir ve hatta çoğu zaman GIT ile ilişkili birçok hastalık için geçerlidir.
Yaygın olarak gut microbiota eğitim önemli olduğunu kabul ederken, karmaşık bir uğraştır. Birden fazla hayvan modeli, zebra balığı, sıçanlar ve fareler, gibi küçük hayvanlardan maymunlar ve domuzlar15-19gibi büyük olanlar tarafından kullanılabilir. Ancak, bu hayvanlar çevre ve diyet dayalı gelmifltir bir benzersiz bakteriyel topluluk var bu yana uygulamanın insan gut microbiota açısından bu hayvanların değil, basittir ve anatomik olarak insanlar20 ‘ den farklıdır , 21. insan denekler kullanımı konu ile ilgili soru kaldırır henüz başka bir dizi zorluklar içerir. İnsan çalışmaları pahalı, zaman alıcı ve etik kısıtlanmış11. Ayrıca, Yaş veya gelişimsel sahne, çevre, diyet, ilaç ve genetik faktörler2,4,22de dahil olmak üzere insan çalışmalarda gut microbiota karıştırıcı faktörler etkiler. Ayrıca ne insanlarda test edilebilir ve örnekleri ne tür ne4hasat edilebilir kısıtlamalar vardır.
Gut microbiota çalışmaya bir vivo içinde sistem kullanarak bir kritik dezavantaj memeli bileşenleri varlığıdır. Gut microbiota ve insan hücreleri birbirleriyle etkileşim ve ayarlama bir in vivo , bu iki ayırt etmek mümkün değildir. Böylece hassas ölçümler hesaplanamaz gut microbiota tarafından üretilen metabolitleri iki nokta üst üste hücreleri tarafından alınır. Bu nedenle, herhangi bir mekanik çalışma noktalardan ölçümleri11‘ e sınırlı olmalıdır. Örnekleri GIT farklı bölgelerinden boyuna hasat yetersizlik içinde vivo çalışmalar için başka bir büyük dezavantajı ise23. Bu saat12üzerinde iki nokta üst üste microenvironments içinde oluşabilecek değişikliklerin değerlendirilmesi için izin vermez. İnsan çalışmaları da dahil olmak üzere birçok in vivo çalışmalar analiz gut microbiota12değişiklikleri algılamak için dışkı örnekleri güveniyor. Bu bilgilendirici olsa da, veri gut microbiota arasında GIT sağlamaz ve luminal ve mukozal topluluklar5,6,7,8arasında ayrım yapmaz.
Gut microbiota için bir vitro yöntemi uygulama olmaksızın memeli bileşenlerinden bakteriyel topluluk dinamiklerini incelemek için gereklidir. Vitro yöntemini kullanarak çevre koşulları10, aynı anda birden çok parametreleri sınama ve boyuna örnek yeteneği ve geniş hacimli11sıkı kontrol sağlar. Mekanik bir aygıt ve bir misafir edemeyeceğiniz bir tüp bebek yöntemi kullanır beri hiçbir dikkat edilecek noktalar yaş, çevre, diyet ya da genetik geçmişi için ihtiyaç vardır. Bu sistemleri tüm gut microbiota topluluk sınamak için kullanılan, yalnızca seçili organizmalar veya hatta tek suşları. Önemlisi, tüp bebek sonuçları tekrarlanabilir, henüz çeşitlilik içinde vivo çalışmalar11,22‘ ye benzer bir düzeyde tutmak.
Söz konusu hipotez ve istenen sonuçları bağlı olarak benn in vitro çalışmalar çeşitli şekillerde yapılabilir. Tek-gemi sistemleri ve tek toplu iş iş kültürleri 24-48 h25boyunca gerçekleştirmek veya fekal homogenate24 örnekleriyle kuluçka gibi basit yöntemler kullanabilir. Onlar da tek gemi sistemleri ve istikrarlı bağırsak mikrobiyal topluluk11üretmek için bir chemostat sistemi kullanmak gibi daha karmaşık yöntemleri kullanarak yapılabilir. Sadece iki nokta üst üste, bir bölümünü temsil ettiği iki nokta üst üste, enine, artan ve azalan bölgelerinde oluşan olsa bile ancak, tek bir reaktör kullanımı microbiota12 aşırı basitleştirebilirsiniz.
İki nokta üst üste (, enine, artan ve azalan bölgeler) farklı bölgelerinde geliştirir gut microbiota toplum eğitim için karmaşık, çok aşamalı bir sistem istihdam edilebilir. Bu sistem, birden fazla gemileri, enine, artan ve azalan bölgelerin gut microbiota yani ekili bağımsız olarak iki nokta üst üste, farklı bölgelerinde taklit etmek için ayarlanır. Bu gemiler, bağlı inen kolon bölgelere enine için artan üzerinden sırayla yüzeylerde taşımak pompaları kullanarak, GIT yoluyla besin akışının taklit.
Bu çalışmanın amacı nasıl 5 kademeli tüp bebek kültür sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) gut microbiota toplum yetiştirmek ve istikrar ve kompozisyon açısından topluluk dinamikleri göstermek için kullanılabilir göstermekti. Bu sistemde bir gemi mide temsil eder ve ince bağırsak temsil eder. İki nokta üst üste (artan, enine, azalan), üç bölgeye her bölge26temsil eden bir gemi ile ayrılmıştır. Bu deneysel kurulumunda iki komple sistemler paralel olarak çalıştırılan, birim 1 ile müsin taşıyıcılara içeren mukozal yüzeyinde ve birim yok müsin taşıyıcıları içeren 2 temsil eder. Her bölge luminal ve mukozal aşamalarında geliştirilen topluluklar 16S rRNA gen sıralama ve SCFA çözümlemesi kullanarak zamanla birbirlerine ve fekal inoculum karşılaştırıldı. Sonuçları sunulan topluluk, kompozisyon ve bu tüp sistemi türünden üretilen işlevsellik açısından hem de türünü gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İn vitro kodlamayla sistemleri kalın bağırsak gut microbiota incelemek için geliştirilmiştir. İki nokta üst üste33her bölge için bir olgun bağırsak mikrobiyal topluluğun büyüme teşvik mide bağırsak, fizyolojik şartlarda benzetimini yapmak için tasarlanmış çizgisel kullanıyorlar. Mantıklı ve anlaşılır bir kavramdır, gut microbiota çalışmaya tüp bebek kodlamayla sistemlerinin gerçek çalışan hassas ve ne gerekli ve güvenilir sonuçlar üretmek için beklenen b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Audrey Thomas-Gahring için onun GC/MS iş kabul edilmektedir. Biz de Massimo Marzorati el yazması düzenleme için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
- Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
- Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
- Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
- Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
- McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
- Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
- Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
- Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
- Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
- McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
- Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
- Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
- Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
- Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
- Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
- Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
- Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
- Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
- Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
- Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
- Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
- Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
- Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
- Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
- Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
- Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
- Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
- Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
- Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
- Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).
