تطبيق متقدم في المختبر استزراع التكنولوجيا لدراسة الحجمية القناة الهضمية البشرية
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لاستزراع الحجمية الأمعاء القولون في المختبر، باستخدام سلسلة من المفاعلات الحيوية التي تحاكي الظروف الفسيولوجية للقناة المعدية المعوية.
Abstract
الحجمية القناة الهضمية البشرية تلعب دوراً حيويا في صحة الإنسان والمرض. دراسة الحجمية الأمعاء باستخدام نموذج في فيفو ، صعب نظراً لطبيعتها المعقدة، وارتباطه المتنوعة مع مكونات الثدييات. والهدف من هذا البروتوكول هو ثقافة الحجمية القناة الهضمية في المختبر، الذي يسمح لدراسة ديناميات الحجمية القناة الهضمية، دون الحاجة إلى النظر في مساهمة الوسط الثدييات. تستخدم في المختبر استزراع التكنولوجيا، هي محاكاة الظروف الفسيولوجية للقناة المعوية المعدية، بما في ذلك معلمات مثل درجة الحموضة ودرجة الحرارة، أنايروبيوسيس، ووقت العبور. هو محاكاة سطح القولون المعوية عن طريق إضافة حاملات المغلفة الميوسين وخلق مرحلة مخاطية وأضاف بعدا جديداً. هو عرض الحجمية القناة الهضمية بتطعيم بمادة البراز البشري. عند التطعيم مع هذا الخليط المعقد من البكتيريا، الميكروبات محددة هي أثري مختلف الطولية (تصاعدي، نقطتين عرضية وتنازلي) والبيئات (لومينال والأغشية المخاطية) مستعرضاً النموذج في المختبر. من الأهمية بمكان للسماح للنظام للوصول إلى حالة مستقرة، التي تبقى مستقرة على المجتمع ونواتج الأيض المنتجة. وتبين النتائج التجريبية في هذه المخطوطة كيف أن القناة الهضمية الملقحين الحجمية يتطور المجتمع إلى مجتمع مستقر على مر الزمن. متى تحقق حالة ثابتة، يمكن استخدام هذا النظام لتحليل التفاعلات البكتيرية ووظائف المجتمع أو لاختبار آثار أي إضافات على الحجمية القناة الهضمية، مثل الأغذية، والمكونات الغذائية أو المستحضرات الصيدلانية.
Introduction
الحجمية القناة الهضمية هو مجتمع كائنات الحية الدقيقة الموجودة في القناة الهضمية البشرية (GIT). ويصل هذا المجتمع إلى التركيز الأقصى في القولون، حيث يقدر أن يعقد البكتيريا-1014 1013، 500-1,000 الأنواع، التي تعيش في التعايش مع القولون الوسط1،2. تغيير تكوين ووظائف الحجمية القناة الهضمية مكانياً على طول جيت، تشكيل مجتمعات المنطقة المحددة، مع تنوع معظم وجدت ديستالي2،3،،من45. لكل منطقة التشريحية، تتواجد المجتمعات الميكروبية منفصلة في التجويف و البطانة المخاطية6. أن المجتمع التجويف لديه الوصول المباشر للمواد الغذائية ركائز التحرك من خلال حجرة لومينال7. وعلى الرغم من ذلك، يقيم بعض البكتيريا تفضيلي في طبقة المخاط، الاستفادة من الميوسين التي تنتجها خلايا القولون كمصدر الطاقة1،،من58. الفرق في ميكرونفيرونمينتس بين نتائج المراحل لومينال والأغشية المخاطية في الاختلاف وتنمية المجتمعات مرحلة محددة. معا، هذه المجتمعات وتوفير وظائف التمثيل الغذائي، مثل استقلاب المواد الغذائية وإنتاج الفيتامينات، والوظائف المناعية، مثل منع الاستعمار من مسببات الأمراض البشرية1،3، 9-الحجمية الأمعاء كما تعمل وظيفيا بالاقتران مع خلايا القولون البشرية3.
كجزء هام من بوابة البشرية، فإنه ليس من المستغرب أن يعرف الحجمية القناة الهضمية للمساهمة في كلا المضيف الصحة والمرض حالة3،9،10،،من1112. تحولاً في السكان الميكروبية الأمعاء ارتبطت بأمراض الإنسان متعددة، بما في ذلك الاضطرابات بوابة مثل أمراض الأمعاء الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين) ومتلازمة الأمعاء الأمعاء (IBS)، ولكن أيضا الأمراض الأخرى، مثل السمنة وأمراض الدورة الدموية، والتوحد 3 , 9 , 10 , 11 , 12-نواتج الأيض المنتجة من الحجمية القناة الهضمية لها تأثير عالمي، الوصول إلى مواقع بعيدة عن ال12،القناة الهضمية13. على سبيل المثال، محور الأمعاء والدماغ المرتبطة باضطرابات نفسية مثل القلق والاكتئاب14. ولذلك، تدرس الحجمية القناة الهضمية المهم إلى حقول متعددة للبحوث، وينطبق على العديد من الأمراض، حتى تلك التي كثيرا ما لا المقترنة بوابة.
في حين أن من المسلم به على نطاق واسع أن من المهم دراسة الحجمية القناة الهضمية، مسعى معقد. نماذج حيوانية متعددة متاحة، من الحيوانات الصغيرة مثل الزرد والجرذان والفئران، إلى الأكبر حجماً مثل القردة والخنازير15-19. ومع ذلك، تطبيق هذه الحيوانات من حيث الحجمية القناة الهضمية البشرية لا واضحة، منذ هذه الحيوانات لديها مجتمع بكتيرية فريدة من نوعها التي تطورت على أساس البيئة والنظام الغذائي، وهم تشريحيا متميزة من البشر20 , 21-استخدام البشر إزالة مسألة ذات صلة حتى الآن تقدم مجموعة أخرى من التحديات. الدراسات الإنسانية هي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وهي مقيدة أخلاقيا11. وعلاوة على ذلك، تؤثر عوامل التباس الحجمية القناة الهضمية في الدراسات الإنسانية، بما في ذلك العمر أو مرحلة النمو والبيئة والنظام الغذائي، الأدوية والعوامل الوراثية2،،من422. وهناك أيضا قيود على ما يمكن أن يكون اختبار في البشر، وأي نوع من العينات يمكن أن تحصد ما هي الأوقات4.
أحد العيوب الحرجة لاستخدام نظام في فيفو لدراسة الحجمية القناة الهضمية هو وجود مكونات الثدييات. الحجمية الأمعاء والخلايا البشرية التي تتفاعل مع بعضها البعض، وفي في فيفو الإعداد، من المستحيل التمييز بين الاثنين. وتؤخذ نواتج الأيض التي تنتجها الحجمية القناة الهضمية خلايا القولون، حيث لا يمكن حساب القياسات بدقة. ولذلك، يجب أن يكون أي دراسة ميكانيكية محدودة إلى نقطة النهاية القياسات11. هو عيب رئيسي آخر للدراسات المجراة في عجز عن حصاد العينات من مناطق مختلفة بوابة طوليا23. وهذا لا يسمح بتقييم التغيرات التي قد تحدث في ميكرونفيرونمينتس القولون على مدى الساعة12. في فيفو دراسات كثيرة، بما في ذلك الدراسات الإنسانية، تعتمد على تحليل عينات البراز للكشف عن التغيرات الحجمية القناة الهضمية12. بينما هذا مفيدة، لا تقدم بيانات عن الحجمية القناة الهضمية عبر بوابة ولا يفرق بين المجتمعات لومينال والأغشية المخاطية5،6،،من78.
الحجمية القناة الهضمية، مطلوب تطبيق أسلوب في المختبر لدراسة ديناميات المجتمع البكتيرية، ودون تدخل من مكونات الثدييات. يسمح استخدام أسلوب في المختبر لمراقبة مشددة من الظروف البيئية10واختبار معلمات متعددة في وقت واحد، والقدرة على أخذ عينات طوليا، وفي أحجام كبيرة11. نظراً لأسلوب في المختبر يستخدم أحد الأجهزة ميكانيكية ولا مضيف، تلزم لا اعتبارات السن، والبيئة، والنظام الغذائي، أو الخلفية الوراثية. هذه النظم يمكن استخدامها لاختبار أما الطائفة الحجمية القناة الهضمية كاملة، فقط تحديد الكائنات، أو السلالات حتى واحد. الأهم من ذلك، النتائج في المختبر استنساخه، وبعد الاحتفاظ بمستوى تنوع مقارنة للدراسات المجراة في11،22.
اعتماداً على فرضية قيد البحث والنتائج المرجوة، وأنا يمكن أن يؤديهاالمختبر ن الدراسات في العديد من الطرق. وهي تستخدم نظم سفينة واحدة وأساليب بسيطة، مثل حضانة عينات البراز هوموجيناتي24 أو أداء الثقافات دفعة واحدة على مدى 24-48 ح25. أنها يمكن أيضا أن يتم ذلك استخدام نظم سفينة واحدة وأساليب أكثر تعقيداً، مثل استخدام نظام تشيموستات لإنتاج مجتمع الميكروبي القناة الهضمية مستقرة11. ومع ذلك، استخدام مفاعل واحد يمكن الإفراط تبسيط الحجمية12 نظراً لأنه يمثل فقط قسم واحد من القولون، على الرغم من القولون ويتألف من مناطق التصاعدي والتنازلي عرضية.
ومن أجل دراسة المجتمع الحجمية القناة الهضمية التي تتطور في مناطق مختلفة من القولون (المناطق التصاعدي والتنازلي عرضية)، يمكن أن تستخدم نظام معقدة ومتعددة المراحل. في هذه الأنظمة، يتم إعداد سفن متعددة لتقليد في مناطق مختلفة من القولون، حيث تزرع الحجمية القناة الهضمية في منطقتي تصاعدي، وعرضية، وتنازلي بشكل مستقل. وترتبط هذه السفن، باستخدام مضخات لنقل ركائز في التسلسل، من الصعود إلى عرضية إلى منطقتي القولون تنازلي، ومحاكاة تدفق المواد الغذائية من خلال بوابة.
وكان الهدف من هذه الدراسة لإظهار كيف نظام 5-مرحلة ثقافة في المختبر (انظر الجدول للمواد) يمكن استخدامها لتنمية المجتمع الحجمية القناة الهضمية، وتثبت ديناميات المجتمع من حيث الاستقرار وتكوين. في هذا النظام، يمثل سفينة واحدة في المعدة وواحدة تمثل في الأمعاء. القولون ينقسم إلى ثلاث مناطق (تصاعدي، عرضية، تنازلي)، مع سفينة واحدة تمثل كل منطقة26. في هذا الإعداد التجريبية، نظامان كاملة تم تشغيلها في نفس الوقت، ومع الوحدة 1 تحتوي على حاملات الميوسين ليمثل سطح الغشاء المخاطي ووحدة 2 التي تحتوي على لا شركات الميوسين. وقورنت المجتمعات التي وضعت في مراحل لومينال والأغشية المخاطية لكل منطقة إلى بعضها البعض، وأن العدوى البراز على مر الزمن باستخدام التسلسل الجيني الرنا الريباسي 16S وتحليل الهيئة. وتبين النتائج المعروضة نوع المجتمع، سواء من حيث تكوينها ووظيفة، والتي يمكن أن تنتج من هذا النوع من النظام في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وضعت نظم تثقيف في المختبر لدراسة الحجمية الأمعاء الغليظة. وهم يستخدمون أجهزة مصممة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المعدي المعوي، تعزيز نمو مجتمع الميكروبية القناة الهضمية ناضجة لكل منطقة في القولون33. في حين أن مفهوم منطقية ومفهومة، يتطلب تشغيل الفعلي لنظم تثقيف في المختبر ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
السيدة أودري توماس-جارينج المسلم للعمل لها GC/MS. كما نود أن نشكر ماسيمو مارزوراتي لتحرير المخطوطة.
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
- Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
- Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
- Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
- Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
- McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
- Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
- Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
- Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
- Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
- McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
- Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
- Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
- Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
- Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
- Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
- Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
- Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
- Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
- Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
- Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
- Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
- Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
- Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
- Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
- Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
- Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
- Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
- Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
- Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
- Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).
