In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung der Darm Microbiota des Dickdarms in-vitro-, mit einer Reihe von Bioreaktoren, die die physiologischen Bedingungen des Magen-Darm-Trakt zu simulieren.
Abstract
Der menschliche Darm Microbiota spielt eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit. Studium der Darm Microbiota mit einem in-Vivo -Modell, ist schwierig, da seine Komplexität und seine vielfältige Verbindung mit Säugetieren Komponenten. Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Darm Microbiota in-vitro-Kultur, die für die Untersuchung der Darm Microbiota Dynamik ermöglicht, ohne den Beitrag des Säugetier-Milieus zu prüfen. Mit in-vitro- Kultivierung Technologie, werden die physiologischen Bedingungen für den Magen-Darm-Trakt simuliert, einschließlich Parameter wie pH-Wert, Temperatur, Anaerobiose und Laufzeit. Die intestinale Fläche des Dickdarms wird simuliert, indem Mucin-beschichtete Träger, eine Schleimhaut Phase erstellen und hinzufügen weitere Dimension. Der Darm Microbiota wird durch impfen mit menschlichen Fäkalien eingeführt. Nach Impfung mit dieser komplexen Mischung von Bakterien, sind bestimmte Mikroben in verschiedenen längs-(aufsteigender, quer- und absteigenden Doppelpunkte) angereichert und transversalen (luminalen und Schleimhaut) Umgebungen von in-vitro-Modell. Es ist entscheidend, kann das System die Steady-State zu erreichen, in dem die Gemeinschaft und die Metaboliten produziert stabil bleiben. Die experimentellen Ergebnisse in dieser Handschrift zeigen wie die beimpften Darm Microbiota Gemeinschaft zu einer stabilen Gemeinschaft im Laufe der Zeit entwickelt. Steady-State erreicht, kann das System um bakterielle Interaktionen und Community-Funktionen zu analysieren oder testen Sie die Auswirkungen der Zusatzstoffe auf den Darm Microbiota, wie Lebensmittel, Lebensmittelbestandteile oder Arzneimittel verwendet werden.
Introduction
Der Darm Microbiota ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die in den menschlichen Magen-Darm-Trakt (GIT) befinden. Diese Gemeinschaft erreicht maximale Konzentration im Dickdarm, die schätzungsweise 1013-1014 Bakterien von 500-1.000 Arten halten das Leben in Symbiose mit dem Doppelpunkt Milieu1,2. Die Zusammensetzung und Funktionsweise der Darm Microbiota ändern räumlich entlang der GIT, bilden bestimmte Gemeinschaften der Region, mit der meisten Vielfalt gefunden nach distal2,3,4,5. Für jede anatomische Region befinden sich separate mikrobielle Gemeinschaften in das Lumen und auf der Schleimhaut-6. Die Lumen-Gemeinschaft hat einen direkteren Zugang zu Nährstoffen Substrate durch den luminalen Fach7zu bewegen. Trotzdem befinden sich einige Bakterien bevorzugt in der Schleimschicht, die Verwendung von Mucin produziert durch den Doppelpunkt-Zellen als Energie Quelle1,5,8. Der Unterschied in Mikroumgebungen zwischen Phasen der luminalen und Schleimhaut führt Divergenz und die Entwicklung der Phase bestimmten Gemeinschaften. Zusammen bieten diese Gemeinschaften Stoffwechselfunktionen wie Nährstoff Stoffwechsel und die Produktion von Vitaminen, und immunologische Funktionen, wie die Verhinderung der Besiedlung von humanpathogenen1,3, 9. Darm Microbiota funktioniert auch funktionell in Konjugation mit dem menschlichen Darm Zellen3.
Als ein wichtiger Bestandteil der menschlichen GIT ist es nicht verwunderlich, dass der Darm Microbiota bekannt ist, auf beiden Host Gesundheit und Krankheit Status3,9,10,11,12beitragen. Eine Verschiebung in der Darm mikrobiellen Population wurde mit mehreren menschlichen Krankheiten, einschließlich GIT Erkrankungen wie Darm Darmerkrankung (IBD) und Darm Darmsyndrom (IBS), sondern auch andere Krankheiten wie Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf-Krankheit und Autismus 3 , 9 , 10 , 11 , 12. Metaboliten aus dem Darm Microbiota hergestellt haben einen globalen Effekt erreichen Orte weit von der Darm-12,–13. Beispielsweise ist die Darm-Gehirn-Achse mit psychischen Störungen wie Angst und Depression14verbunden. Daher studieren der Darm Microbiota ist wichtig, mehrere Forschungsfelder und gilt für viele Krankheiten, auch diejenigen, die nicht oft im Zusammenhang mit der GIT.
Während es allgemein anerkannt ist, dass der Darm Microbiota Studium wichtig ist, ist es ein kompliziertes Unterfangen. Mehreren Tiermodellen stehen zur Verfügung, von kleinen Tieren wie Zebrafisch, Ratten und Mäuse, größeren wie Affen und Schweine15-19. Jedoch die Anwendung dieser Tiere in Bezug auf den menschlichen Darm Microbiota ist nicht einfach, da diese Tiere haben eine einzigartige bakterielle Gemeinschaft, die sich entwickelt hat basierend auf Umwelt und Ernährung, und sie unterscheiden sich anatomisch von Menschen20 , 21. die Verwendung von menschlichen Probanden entfernt die Frage der Relevanz noch stellt eine weitere Reihe von Herausforderungen. Studien am Menschen sind teuer, zeitaufwändig, und ethisch eingeschränkte11. Darüber hinaus beeinflussen Störfaktoren der Darm Microbiota in Studien am Menschen, einschließlich Alter oder Entwicklungsstadium, Umwelt, Ernährung, Medikation und genetische Faktoren2,4,22. Es gibt auch Beschränkungen was am Menschen getestet werden kann, und welche Art von Proben zu welchen Zeiten4geerntet werden kann.
Ein kritischer Nachteil mit einem in-Vivo -System, um der Darm Microbiota zu studieren ist das Vorhandensein von Säugetieren Komponenten. Der Darm Microbiota und menschlichen Zellen, die miteinander interagieren, und in einer in Vivo festlegen, ist es unmöglich, die beiden zu unterscheiden. Die Metaboliten von Darm Microbiota produziert sind durch den Doppelpunkt-Zellen getroffen, so präzise Messungen berechnet werden können. Daher muss mechanistische Studie auf Endpunkt Messungen11beschränkt. Ein weiterer großer Nachteil für in vivo Studien ist die Unfähigkeit, Proben aus den verschiedenen Regionen von der GIT längs Ernte23. Dies lässt sich nicht für die Beurteilung der Veränderungen, die über Zeit12in Mikroumgebungen des Dickdarms auftreten können. Viele in Vivo Studien, einschließlich Humanstudien, verlassen sich auf Analyse der Stuhlproben, Änderungen an den Darm Microbiota12zu erkennen. Dies ist zwar informativ, es liefert keine Daten auf den Darm Microbiota über GIT und unterscheidet nicht zwischen der luminalen und Schleimhaut Gemeinschaften5,6,7,8.
Für den Darm Microbiota ist die Anwendung einer in-vitro- Methode erforderlich, um die Dynamik der bakteriellen Gemeinschaft, ohne Einmischung von den Säugetieren Komponenten zu studieren. Mit einer in-vitro- Methode ermöglicht die strenge Kontrolle der Umweltbedingungen10, gleichzeitig von mehreren Parametern testen und die Fähigkeit, probieren Sie längs und in großen Mengen11. Da eine in-vitro-Methode ein mechanisches Gerät und kein Host verwendet, werden keine Überlegungen für Alter, Umwelt, Ernährung oder genetischen Hintergrund benötigt. Diese Systeme können verwendet werden, um entweder den gesamten Darm Microbiota Gemeinschaft testen, nur ausgewählte Organismen oder sogar einzelne Stämme. Wichtig ist, in-vitro-Ergebnisse sind reproduzierbar, behalten noch ein Maß an Vielfalt in vivo Studien11,22vergleichbar.
Je nach der Hypothese in Frage und die gewünschten Ergebnisse ichn-vitro- Studien können auf vielfältige Weise durchgeführt werden. Sie können einzelne Gefäßsysteme und einfache Methoden, wie Inkubation Proben mit fäkalen Homogenat24 oder Durchführung einzelner Batch Kulturen im Laufe von 24-48 h25nutzen. Sie können auch mit einzelnen Gefäßsysteme und komplexere Methoden, z. B. mit einem Chemostat System herstellen einer stabilen Darm mikrobiellen Gemeinschaft11erreicht werden. Jedoch kann die Verwendung eines einzigen Reaktors Mikrobiota12 vereinfachen da es nur einen Abschnitt des Dickdarms, darstellt, obwohl der Doppelpunkt der auf-, quer- und absteigenden Regionen besteht.
Um den Darm Microbiota Gemeinschaft zu studieren, die in den verschiedenen Regionen des Dickdarms (der auf-, quer- und absteigenden Regionen) entwickelt, ist eine komplexe, mehrstufige System einsetzbar. In diesen Systemen werden mehrere Schiffe eingerichtet, um die verschiedenen Regionen des Dickdarms, zu imitieren, damit der Darm Microbiota der auf-, quer- und absteigenden Regionen werden unabhängig voneinander angebaut. Diese Schiffe sind verbunden, mit Pumpen Substrate in Reihenfolge von der aufsteigende, die quer zu den absteigenden Dickdarm Regionen bewegen, imitiert den Fluss von Nährstoffen durch die GIT.
Das Ziel dieser Studie war es zu zeigen, wie eine in-vitro-5-Stufen-Kultursystem (siehe Tabelle der Materialien), die Darm Microbiota Gemeinschaft zu pflegen und zu Dynamik der Gemeinschaft in Bezug auf Stabilität und Zusammensetzung verwendet werden kann. In diesem System ein Schiff stellt den Magen und Dünndarm darstellen. Der Doppelpunkt gliedert sich in drei Regionen (aufsteigend, quer, absteigend), mit einem Schiff aus jeder Region26. In diesem Versuchsaufbau wurden zwei komplette Systeme parallel laufen, mit 1 mit Mucin Träger stellt die Schleimhautoberfläche und Unit 2, enthält keine Mucin-Träger. Die Gemeinden, die in der luminalen und Schleimhaut Phasen der einzelnen Regionen entwickelt wurden im Laufe der Zeit mit 16 s rRNA-Gen-Sequenzierung und Analyse der SCFA zueinander und zu den fäkalen Inokulum verglichen. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen die Art der Gemeinschaft, sowohl in Bezug auf Zusammensetzung und Funktionen, die aus dieser Art von in-vitro-System hergestellt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In-vitro-Kultivierung Systeme wurden entwickelt, um den Darm Microbiota des Dickdarms zu studieren. Sie verwenden Apparate entwickelt, um die physiologischen Bedingungen die Magen-Darm-Trakt, fördert das Wachstum einer Reifen Darm mikrobiellen Gemeinschaft für jeden Bereich des Dickdarms33zu simulieren. Während der Begriff logisch und nachvollziehbar ist, erfordert der tatsächlichen Ablauf des in-vitro-Kultivierung Systeme, der Darm Microbiota zu studieren Präzision und ein Verständnis desse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Frau Audrey Thomas-Gahring ist bekannt für ihre GC/MS arbeiten. Wir möchten auch Massimo Marzorati danken für das Manuskript zu bearbeiten.
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
- Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
- Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
- Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
- Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
- McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
- Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
- Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
- Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
- Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
- McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
- Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
- Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
- Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
- Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
- Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
- Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
- Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
- Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
- Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
- Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
- Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
- Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
- Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
- Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
- Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
- Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
- Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
- Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
- Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
- Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).
