Применение передовых в Vitro культивирования технологии для изучения человеческого кишка микробиоты
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для культивирования микрофлору кишечника толстой кишки в лабораторных условиях, с помощью серии биореакторов, которые имитируют физиологических состояниях желудочно кишечного тракта.
Abstract
Микробиота кишечнике человека играет жизненно важную роль в здоровье и болезни. Изучая микрофлору кишечника, с использованием модели в естественных условиях , затруднено из-за ее сложный характер и его различные ассоциации с млекопитающих компонентов. Целью настоящего Протокола является культура микрофлору кишечника в пробирке, который позволяет для изучения динамики микрофлору кишечника, без необходимости учитывать вклад млекопитающих окружение. Использование в vitro культивирования технологии, физиологических состояниях желудочно кишечного тракта моделируются, включая такие параметры, как pH, температуры, anaerobiosis и транзитного времени. Поверхность кишечника толстой кишки моделируется путем добавления муцина покрытием перевозчиков, создании слизистой фазы и добавляя новое измерение. Кишка микробиоты вводится прививки с человеческие фекалии. После прививки с этой сложной смеси бактерий, конкретные микробы обогащаются в различных продольной (по возрастанию, поперечной, так и по убыванию двоеточия) и поперечные (люминал и слизистых оболочек) средах в пробирке модели. Важно, чтобы система для достижения устойчивого состояния, в котором общины и метаболитов производства остаются стабильными. Результаты экспериментов в этой рукописи продемонстрировать, каким образом привитых кишка микробиоты сообщество превращается в стабильное сообщество со временем. После того, как устойчивое состояние достигается, система может использоваться для анализа бактериальных взаимодействий и функциям сообщества или проверить последствия каких-либо добавок на микрофлору кишечника, таких как продукты питания, пищевые компоненты или фармацевтических препаратов.
Introduction
Кишка микробиоты представляет собой сообщество микро организмов, которые проживают в человека желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Это сообщество достигает максимальной концентрации в толстой кишке, который оценивается провести 1013-1014 бактерий, от 500-1000 видов, которые живут в симбиозе с толстой обстановке1,2. Состав и функциональные возможности кишка микробиоты изменить пространственно вдоль GIT, образуя конкретные общины региона, с наиболее разнообразия нашли дистально2,3,4,5. Для каждого анатомического региона отдельных микробных сообществ находятся в просвете и на слизистую6. Люмен сообщество имеет более прямой доступ к питательные вещества как субстраты двигаться через Люминал отсека7. Несмотря на это некоторые бактерии находятся преимущественно в слой слизи, используя муцина, производятся клетками кишечника как источник энергии в1,5,8. Разница в микросреды между фазами Люминал и слизистой приводит к дивергенции и развития фазы конкретных общин. Вместе эти общины обеспечивают метаболические функции, такие как обмен питательных веществ и производство витаминов и иммунологической функции, такие как предотвращение колонизации патогенов человека1,3, 9. кишка микробиоты функционально работает также в конъюгации с клетки человека Колон3.
Как важной частью человеческого GIT это не удивительно, что кишка микробиоты известен вклад обеих принимающих здоровья и болезни статус3,9,10,11,12. Сдвиг в кишечнике микробной популяции был связан с несколькими заболеваний человека, включая GIT расстройств, таких как заболевания кишечника кишечника (IBD) и синдром кишечника кишечника (IBS), но и других заболеваний, как ожирение, сердечно-сосудистые заболевания и аутизм 3 , 9 , 10 , 11 , 12. метаболитов, образующихся кишка микробиоты иметь глобальный эффект, достигнув места вдали от кишки12,13. Например оси кишки мозг связан с психическими расстройствами как тревога и депрессия14. Таким образом изучая кишка микробиоты имеет важное значение для нескольких областях исследований и применимы для многих заболеваний, даже тех, кто не часто ассоциируется с GIT.
Хотя широко признается, что изучение кишка микробиоты имеет важное значение, это сложной работе. Несколько животных моделей доступны, от мелких животных как данио рерио, крыс и мышей, крупные как обезьян и свиней15-19. Однако применение этих животных с точки зрения человека кишка микробиоты не прост, поскольку эти животные имеют уникальный бактериальных сообщество, которое развивалась по окружающей среде и диеты, и анатомически они отличаются от людей20 , 21. использование человеческих субъектов снимает вопрос о релевантности еще вводит другой набор проблем. Человеческие исследования являются дорого, много времени и этически ограниченного11. Кроме того отягощающих факторов влияют на микрофлору кишечника в человеческих исследований, в том числе возраст или стадии развития, окружающей среды, питание, лекарства и генетические факторы2,4,22. Существуют также ограничения на то, что может быть проверена в людей, и какой тип образцов могут быть собраны на то, что раз4.
Один из критических недостатков использования системы в естественных условиях для изучения микрофлору кишечника является наличие у млекопитающих компонентов. Кишка микробиоты и человеческие клетки взаимодействуют друг с другом, и в в естественных условиях , невозможно отличить два. Метаболитов, производимые кишка микробиоты принимаются клетки толстой кишки, поэтому измерения не может быть рассчитана с точностью. Таким образом любой механистической исследования должна быть ограничена конечной точки измерения11. Другой основной недостаток в vivo исследований является неспособность собирать образцы из различных регионов GIT продольно23. Это не позволяет для оценки изменений, которые могут произойти в микросреды двоеточие над время12. Многие в vivo исследования, включая исследования человека, полагаются на анализ фекальных проб для выявления изменений в кишка микробиоты12. Хотя это информативный, он не предоставляет данные на микрофлору кишечника через GIT и не делает различий между общин Люминал и слизистой5,6,,78.
Для кишка микробиоты применение метода в vitro требуется для изучения динамики бактериальной сообщества, без помех от млекопитающих компонентов. С помощью метода в vitro позволяет жесткий контроль условий окружающей среды10, тестирование нескольких параметров одновременно, и возможность попробовать продольно и в больших объемах11. Поскольку метод экстракорпорального использует механические устройства и не принимающих, никакие соображения необходимы для возраста, окружающей среды, диета или генетический фон. Эти системы могут быть использованы для проверки либо весь кишка микробиоты сообщества, только выбранных организмов, или даже отдельных штаммов. Главное, воспроизводимые результаты in vitro, но сохранить уровень разнообразия, сопоставимые с в-vivo исследований11,22.
В зависимости от гипотезы в вопросе и желаемые результаты яn vitro исследования могут выполняться различными способами. Они могут использовать одно судно систем и простые методы, такие как инкубации пробы с фекальными огневки24 или выполнение единого пакета культур в течение 24-48 ч25. Они могут также быть выполнено с использованием систем одного судна и более сложных методов, например с помощью chemostat системы для производства стабильных кишки микробных11. Однако использование одного реактора могут чрезмерно упростить микробиоты12 так, как он представляет только одну часть толстой кишки, даже несмотря на то, что толстой кишки состоит из регионов по возрастанию, поперечной и по убыванию.
С целью изучения кишка микробиоты сообщество, которое развивается в различных регионах толстой кишки (по возрастанию, поперечная и убыванию регионов), комплекс, многоступенчатой системы могут быть использованы. В этих системах для имитации различных регионах толстой кишки, поэтому кишка микробиоты регионов по возрастанию, поперечная и убыванию выращивают самостоятельно настроены несколько судов. Эти суда связаны, с помощью насосов для перемещения субстратов в последовательности по возрастанию поперечно к нисходящей толстой регионов, подражая поток питательных веществ через GIT.
Целью данного исследования было продемонстрировать, как систему 5-этап в пробирке культуры (см. Таблицу материалы) может использоваться культивировать сообщества микрофлору кишечника, а также продемонстрировать динамики сообщества с точки зрения стабильности и композиции. В этой системе одно судно представляет живот и один представляют тонкой кишки. Толстой кишки состоит из трех регионов (по возрастанию, поперечная, по убыванию), с одним судном, представляющих каждый регион26. В этой экспериментальной установки два полных систем были параллельно, с 1 единицу содержащие муцина перевозчиков представляет слизистой поверхности и УКПГ-2, содержащие не муцина перевозчиков. Общины, которые разработаны на этапах Люминал и слизистых оболочек каждого региона были сопоставлены друг к другу и фекальных посевным материалом со временем с помощью последовательности гена 16S рРНК и SCFA анализ. Представленные результаты свидетельствуют тип сообщества, как с точки зрения состава и функциональность, который может быть получен от данного типа в пробирке системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В лабораторных условиях культивирования системы были разработаны для изучения микрофлору кишечника толстой кишки. Они используют аппараты, предназначенные для моделирования физиологических состояниях желудочно кишечного тракта, способствуя росту Зрелые кишечнике микроорганизмов …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Г-жа Одри Томас-Gahring признается за ее ГХ/МС. Мы также хотели бы поблагодарить Massimo Marzorati для редактирования рукопись.
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
- Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
- Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
- Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
- Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
- McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
- Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
- Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
- Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
- Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
- McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
- Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
- Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
- Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
- Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
- Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
- Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
- Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
- Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
- Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
- Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
- Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
- Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
- Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
- Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
- Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
- Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
- Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
- Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
- Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
- Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).
