体外養殖人間の腸内細菌を研究する技術を適用する高度な
Summary
ここでは、胃腸管の生理的条件をシミュレートするバイオリアクターの一連を使用して体外のコロン,の腸内細菌を培養するためのプロトコルを提案する.
Abstract
人間の腸内細菌は、人間の健康と病気の両方で重要な役割を果たしています。生体内でモデルを用いた腸内微生物叢を勉強して、その複雑な自然や多様な哺乳類のコンポーネントのために困難です。このプロトコルの目的は、in vitro における腸内細菌叢ダイナミクスの研究は、哺乳類の環境の貢献を考慮することがなく、感情的な microbiota の文化です。体外培養技術を使用して、pH、温度、嫌気、通過時間などのパラメーターを含む胃腸管の生理的条件はシミュレートされます。結腸の腸の表面は粘液コーティング キャリアを追加する、粘膜のフェーズを作成、さらに次元を追加することでシミュレートされます。腸内細菌は人間の糞便材料の接種によって導入されました。異なる縦方向 (昇順、横断および下向きコロン) で濃縮され特定微生物細菌のこの複雑な混合物で接種時に、in vitro のモデルの横 (内腔と粘膜) 環境。コミュニティと生成される代謝物の安定したまま安定した状態に到達するためのシステムを許可することが重要です。本稿では実験の結果は、接種の腸内細菌叢のコミュニティが時間をかけて安定した社会に開発する方法を示します。定常状態が達成されればシステムは細菌の相互作用およびコミュニティ機能を分析したり、腸内細菌、食品、食品成分、医薬品などの任意の添加物の効果をテストするために使用できます。
Introduction
腸内細菌は、人間の消化管 (GIT の) 内に存在する微生物のコミュニティです。 このコミュニティでは、コロン、コロン環境1,2との共生に住んでいる 500 1,000 種から、10 の13-1014細菌を保持するために推定される最大濃度に達する。組成と腸内細菌の機能は遠位2,3,4、5が見つかりましたほとんどの多様性と地域の特定のコミュニティを形成、GIT に沿った空間的変更します。解剖学的地域ごとに別々 の微生物群集は内腔の粘膜内層6を存在します。ルーメン コミュニティは、基板を通過内腔コンパートメント7栄養素を直接アクセス。それにもかかわらず、いくつかの細菌は、優先的にエネルギー ソース1,5,8としてコロンの細胞によって生成される粘液を利用した粘液層に存在します。内腔と粘膜の段階の微小の違いは、発散と相の特定のコミュニティの開発の結果します。栄養代謝やビタミンの生産などの代謝機能と免疫機能、人間の病原体1,3,の植民地化を防止するなど、一緒にこれらのコミュニティを提供します。9. 腸内細菌はまた、人間のコロンの細胞3との抱合の機能的動作します。
人間の GIT の重要な部分としては腸内細菌が両方ホスト健康と病気の状態3,9,10、11,12に貢献する知られている驚くべきとしてます。腸内微生物群集の変化は GIT 腸腸疾患 (IBD) と腸腸症候群 (IBS) も自閉症、循環器疾患、肥満などの他の疾患のような疾患を含む複数の人間の病気に関連付けられています。3,9,10,11,12. 代謝物の腸内細菌は腸12,13から離れた位置に達するグローバルな効果を持っています。たとえば、腸と脳のつながりは14不安や抑うつなどの精神障害に関連付けられます。したがって、腸内細菌の研究は重要な研究では、複数のフィールドに、であっても、GIT にはしばしば関連付けられている多くの病気に適用されます。
腸内細菌の研究が重要であることは広く認識されて、それは複雑な試みです。複数の動物モデルが猿と豚の15-19のような大きなものにゼブラフィッシュ, ラットおよびマウスのような小動物から、利用可能です。ただし、これらの動物は、ユニークな細菌に基づいて、コミュニティに進化している環境と食事を持っているので、人間の腸内微生物叢の面でこれらの動物のアプリケーションは簡単ではないと彼らは解剖学的人間20とは区別されます。,21. 被験者の使用の妥当性の問題が削除されますまだ課題の別のセットが導入されています。人間研究、高価な時間のかかるで、倫理的制約付き11です。また、交絡因子年齢や発達段階、環境、ダイエット、薬、および遺伝的要因2,4,22を含む人間の研究で腸内細菌に影響を与えます。 また、何が人間でテストできます、サンプルの種類は、4回で収穫できる制限があります。
体内システムを使用しての腸内細菌を研究する 1 つの重要な欠点は、哺乳類のコンポーネントの存在です。腸内細菌とヒトの細胞は、相互に対話し、は生体内で設定、それは 2 つを区別することは。腸内細菌によって生成される代謝産物は、測定精度と計算できないので大腸細胞によってで撮影されます。したがって、任意の機構論的研究はエンドポイント測定11に限定される必要があります。生体内での研究のもう一つの主要な欠点は縦 GIT のさまざまな地域からのサンプルを収穫できない23。これは時間12大腸の微小で生じる変化の評価はできません。 多く生体内での研究、人間の研究などは、糞便の腸内細菌叢12への変更を検出するための解析に依存します。これは有益ではない、それは GIT にわたって腸内細菌に関するデータを提供せず、内腔と粘膜のコミュニティ5,6,7、8を区別しません。
腸内細菌で、哺乳類のコンポーネントからの干渉なしの細菌群集の動態を研究するための in vitro法の適用が必要です。タイトな制御環境条件10、同時に、複数のパラメーターのテストと縦、サンプリング能力および大量11体外メソッドを使用できます。機械装置とホストではなく、in vitro 法を使いこなしますので、年齢、環境、食事、遺伝的背景を考慮事項は必要ありません。これらのシステムはどちらか全体の腸内細菌叢のコミュニティをテストするため、生物、または単一の菌株を選択したのみ。重要なは、生体外で結果が再現可能なまだ体内研究11,22に匹敵する多様性のレベルを保持します。
問題の仮説および目的の結果に応じて私n vitro研究はさまざまな方法で実行できます。 彼らは、単一容器系と糞便ホモジネート24サンプルをインキュベート 24-48 h25のコース上単一のバッチ文化の実行など、簡単な方法を利用できます。単一容器システムと安定した腸内微生物群集11を生成するケモスタット システムを使用するなどのより複雑な方法を使用して行うこともできます。ただし、単一リアクターの使用過剰簡略化できます叢12コロンの 1 つのセクションのみを表すのでにもかかわらず、コロン、昇順、降順、横方向領域で構成されます。
コロン (昇順、降順、横方向領域) の様々 な地域で開発して腸内細菌叢のコミュニティを研究するために、多段階の複雑なシステムを用いることができます。これらのシステムで複数の船は昇順、降順、横方向領域の腸内細菌は独立して栽培されないので、コロンのさまざまな地域を模倣するように設定されます。これらの血管は接続されているポンプを使用して降順大腸領域に横行結腸の順で基板を移動する、GIT による栄養素の流れを模倣しました。
本研究の目的は、5 段階の培養システム (材料の表を参照してください) できます使用方法腸内細菌叢のコミュニティを育成し、安定性と組成の面で群集の動態を発揮を実証することでした。このシステムの 1 つの容器、胃を表し 1 つ小腸。コロンは、各地域の26を表す 1 つの容器で (横を昇順、降順)、3 つの領域に分かれています。この実験装置では、2 つの完全なシステムは、並列で実行した、ユニット 1 ムチンのキャリアを含む表す粘膜と粘液のキャリアが含まれていないユニット 2。各地域の内腔および粘膜の段階で開発されたコミュニティは 16S rRNA 遺伝子配列と SCFA 解析を使用して時間をかけて、お互いに、糞便中の菌を比較しました。示された結果は、コミュニティ、両方の組成および in vitro システムのこのタイプから作り出すことができる機能の種類を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
体外培養システムは、大腸の腸内細菌を研究して開発されています。器具コロン33の地域ごとの成熟した腸内微生物群集の成長を促進、胃消化器官の生理学的条件をシミュレートするように設計を使用します。腸内細菌を研究する体外培養システムの実際の実行の概念は、論理的でわかりやすいですが、精度と信頼性の高い結果を生成すると予想し、が何必要の理解を必要?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
さんオードリー トーマス Gahring は、彼女の GC/MS の仕事のために認められています。原稿を編集のマッシモ Marzorati に感謝したいと思いますまた。
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
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