Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para cultivo a microbiota do intestino do cólon in vitro, usando uma série de biorreatores que simulam as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal.
Abstract
A microbiota do intestino humano desempenha um papel vital na saúde e na doença. Estudar a microbiota do intestino utilizando um modelo in vivo , é difícil devido à sua natureza complexa e sua associação diversificada com componentes dos mamíferos. O objetivo do presente protocolo é cultura a microbiota do intestino in vitro, que permite o estudo da dinâmica de microbiota do intestino, sem ter que considerar a contribuição do meio de mamíferos. Usando em vitro tecnologia de cultivo, as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal são simuladas, incluindo parâmetros como pH, temperatura, anaerobiose e tempo de trânsito. A superfície intestinal do cólon é simulada adicionando transportadoras revestidas mucina, criando uma fase da mucosa, e adicionando outra dimensão. A microbiota do intestino é introduzida por inocular com o material fecal humano. Após a inoculação com esta mistura complexa de bactérias, micróbios específicos são enriquecidos na diferentes longitudinal (ascendente, transversais e descendentes de dois-pontos) e transversais (luminal e da mucosa) ambientes do modelo in vitro. É crucial permitir que o sistema alcança um estado estacionário, em que a Comunidade e os metabólitos produzidos permanecem estáveis. Os resultados experimentais neste manuscrito demonstram como a comunidade de microbiota do intestino inoculados se desenvolve em uma comunidade estável ao longo do tempo. Uma vez que o estado estacionário é alcançado, o sistema pode ser usado para analisar interações bacterianas e funções de Comunidade ou para testar os efeitos de quaisquer aditivos sobre a microbiota do intestino, tais como alimentos, componentes de alimentos ou produtos farmacêuticos.
Introduction
A microbiota do intestino é uma comunidade de microorganismos que residem no trato gastrointestinal humano (GIT). Esta comunidade atinge a concentração máxima no cólon, que é estimado para segurar 10-13-1014 bactérias, de 500-1.000 espécies, que vivem em simbiose com o meio de cólon1,2. A composição e a funcionalidade da microbiota do intestino espacialmente mudam ao longo do GIT, formando comunidades específicas da região, com a maioria dos diversidade encontrada distalmente2,3,4,5. Para cada região anatômica, separadas das comunidades microbianas residem no lúmen e no forro mucosal6. A comunidade de lúmen tem acesso mais direto aos nutrientes como substratos se move através do compartimento luminal7. Apesar disso, algumas bactérias residam preferencialmente na camada de muco, utilizando mucina produzida pelas células do cólon como energia fonte1,5,8. A diferença entre as fases luminal e mucosas microambiente que resulta em divergência e o desenvolvimento de comunidades específicas de fase. Juntas, estas comunidades fornecem funções metabólicas, tais como o metabolismo de nutrientes e a produção de vitaminas e funções imunológicas, tais como prevenir a colonização de patógenos humanos1,3, 9. a microbiota do intestino também funciona funcionalmente em conjugação com as células de cólon humano3.
Como uma parte importante do GIT humano, não é surpreendente que a microbiota do intestino é conhecida por contribuir para ambos anfitrião saúde e doença estatuto3,9,10,11,12. Uma mudança na população microbiana do intestino tem sido associada com várias doenças humanas, incluindo transtornos do GIT como doença intestinal intestinal (IBD) e síndrome do intestino (IBS), mas também de outras doenças, como obesidade, doenças circulatórias e autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabólitos produzidos a partir da microbiota do intestino tem um efeito global, atingindo locais longe do intestino12,13. Por exemplo, o eixo do intestino-cérebro é associado com transtornos mentais, como ansiedade e depressão14. Portanto, estudar a microbiota do intestino é importante para vários campos de pesquisa e é aplicável a muitas doenças, mesmo aqueles não frequentemente associada com o GIT.
Enquanto é amplamente reconhecido que a microbiota do intestino a estudar é importante, é uma tarefa complicada. Vários modelos animais estão disponíveis, desde pequenos animais como o peixe-zebra, ratos e camundongos, para maiores como macacos e porcos,15-19. No entanto, a aplicação destes animais em termos da microbiota do intestino humano é não simples, desde que estes animais têm uma comunidade única bacteriana que evoluiu com base no ambiente e dieta, e eles são anatomicamente distintos dos seres humanos20 , 21. o uso de cobaias humanas, remove a questão da relevância, no entanto, apresenta um outro conjunto de desafios. Estudos em humanos são caros, consomem tempo e são eticamente restrita11. Além disso, fatores de confundimento influenciam a microbiota do intestino em estudos humanos, incluindo a idade ou grau de desenvolvimento, ambiente, dieta, medicação e fatores genéticos,2,4,22. Também há restrições sobre o que pode ser testado em seres humanos, e que tipo de amostras pode ser colhido no qual vezes4.
Uma desvantagem crítica de usar um sistema na vivo para estudar a microbiota do intestino é a presença de componentes dos mamíferos. A microbiota do intestino e células humanas interagem um com o outro, e em um no vivo definindo, é impossível distinguir os dois. Os metabólitos produzidos pela microbiota do intestino são tomados pelas células do cólon, então as medidas não podem ser calculadas com precisão. Portanto, qualquer estudo mecanicista deve ser limitado aos pontos de extremidade medições11. Outra grande desvantagem para estudos in vivo é a incapacidade para colher amostras de diferentes regiões do GIT longitudinalmente23. Isto não permite a avaliação das mudanças que podem ocorrer no microambiente do cólon ao longo do tempo12. Muitos na vivo estudos, incluindo os humanos, dependem de análise de amostras fecais para detectar as alterações para o intestino microbiota12. Enquanto isso é informativo, ele não fornece dados sobre a microbiota do intestino através do GIT e não faz distinção entre as comunidades luminal e mucoso5,6,7,8.
A microbiota do intestino, a aplicação de um método em vitro é necessário estudar a dinâmica da comunidade bacteriana, sem interferência dos componentes dos mamíferos. Usar um método em vitro permite o controle apertado de condições ambientais10testes de vários parâmetros simultaneamente e a capacidade de amostra longitudinalmente e em grandes volumes11. Desde que um método in vitro utiliza um dispositivo mecânico e não uma série, sem considerações são necessárias para idade, ambiente, dieta ou plano de fundo genético. Estes sistemas pode ser usado para testar de qualquer comunidade de microbiota intestino inteiro, somente selecionado organismos, ou mesmo única cepas. Importante, os resultados in vitro são reproduzíveis, ainda manter um nível de diversidade comparável para estudos in vivo11,22.
Dependendo da hipótese em questão e os resultados desejados, eun vitro estudos podem ser realizados de várias formas. Eles podem utilizar sistemas single-navio e métodos simples, como incubar as amostras fecais homogenate24 ou executar culturas único lote ao longo de 24-48 h25. Eles também podem ser realizados usando sistemas single-navio e métodos mais complexos, como o uso de um sistema de quimiostato para produzir um intestino estável comunidade microbiana11. No entanto, o uso de um único reator over simplificar a microbiota12 desde que representa apenas uma parte do cólon, mesmo que o cólon é composto por regiões ascendentes, transversais e descendentes.
Para estudar a comunidade de microbiota do intestino que se desenvolve nas diferentes regiões do cólon (ascendentes, transversais e descendentes regiões), um sistema complexo, com vários estágio pode ser empregado. Nestes sistemas, vários navios estão constituídos para imitar as diferentes regiões do cólon, então a microbiota do intestino das regiões ascendentes, transversais e descendentes são cultivados de forma independente. Estes vasos são conectados, usando bombas para mover substratos em sequência, a partir do ascendente para o transverso às regiões do cólon descendente, imitando o fluxo de nutrientes através do GIT.
O objetivo deste estudo foi demonstrar como um sistema de cultura in vitro de 5 estágios (ver Tabela de materiais) pode ser usado para cultivar a Comunidade microbiota do intestino e para demonstrar a dinâmica da Comunidade em termos de estabilidade e composição. Neste sistema, um navio representa o estômago e um representar o intestino delgado. O cólon é dividido em três regiões (ascendente, transverso, descendente), com um navio que representa cada região26. Nesta instalação experimental, dois sistemas completos foram executados em paralelo, com 1 unidade contendo portadores de mucina que representa a superfície da mucosa e unidade 2 contendo não portadores de mucina. As comunidades que se desenvolveu nas fases de luminal e da mucosa de cada região foram comparadas entre si e para o inóculo fecal ao longo do tempo usando análise de CCPA e sequenciamento de gene 16S rRNA. Os resultados apresentados demonstram o tipo de comunidade, tanto em termos de composição e funcionalidade, que pode ser produzida a partir deste tipo de sistema in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistemas de cultivo in vitro foram desenvolvidos para estudar a microbiota do intestino do intestino grosso. Eles usam aparelhos projetados para simular as condições fisiológicas do tracto gastro intestinal, promovendo o crescimento de uma comunidade microbiana do intestino maduro para cada região do cólon33. Enquanto o conceito é lógico e compreensível, o funcionamento real dos sistemas de cultivo in vitro para o estudo da microbiota do intestino exige precisão e uma compreensão do que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sra. Audrey Thomas-Gahring é reconhecido por seus GC/MS de trabalho. Gostaríamos também de agradecer Massimo Marzorati para editar o manuscrito.
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
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