L'applicazione di avanzate In Vitro coltura tecnologia per studiare il Microbiota dell'intestino umano
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la coltura del microbiota dell’intestino, del colon in vitro, , utilizzando una serie di bioreattori che simulano le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale.
Abstract
Il microbiota dell’intestino umano svolge un ruolo vitale nella salute umana e la malattia. Studiare il microbiota dell’intestino utilizzando un modello in vivo , è difficile a causa della sua natura complessa e la sua associazione diversificata con componenti dei mammiferi. L’obiettivo del presente protocollo è alla cultura il microbiota dell’intestino in vitro, che consente lo studio delle dinamiche del microbiota intestinale, senza dover considerare il contributo del milieu dei mammiferi. Utilizzando in vitro coltura tecnologia, sono simulate le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale, inclusi i parametri quali pH, temperatura, anaerobiosi e tempo di transito. La superficie intestinale del colon viene simulata aggiungendo elementi portanti rivestite con mucina, creazione di una fase della mucosa, e aggiungendo ulteriore dimensione. Il microbiota dell’intestino è stato introdotto inoculando con il materiale fecale umano. Al momento dell’inoculazione con questa complessa miscela di batteri, microbi specifici sono arricchiti in diversi longitudinale (ascendente, trasversale e discendente colon) e trasversali (luminal e mucosi) ambienti del modello in vitro. È fondamentale per consentire al sistema di raggiungere uno stato di costante, in cui la Comunità e i metaboliti prodotti rimangono stabili. I risultati sperimentali in questo manoscritto dimostrano come la comunità di microbiota inoculato intestino si sviluppa in una comunità stabile nel tempo. Una volta allo stato stazionario è raggiunto, il sistema può essere utilizzato per analizzare le interazioni batteriche e funzioni della community o per testare gli effetti di eventuali additivi sul microbiota dell’intestino, quali cibo, componenti alimentari o prodotti farmaceutici.
Introduction
Il microbiota dell’intestino è una comunità di microrganismi che risiedono nel tratto gastrointestinale umano (GIT). Questa comunità raggiunge la massima concentrazione nel colon, che è stimato per contenere 1013-1014 batteri, da 500-1.000 specie, che vivono in simbiosi con il colon milieu1,2. La composizione e la funzionalità del microbiota cambiare nello spazio lungo il GIT, formando comunità specifiche di regione, con la maggior parte delle diversità trovata distalmente2,3,4,5. Per ogni regione anatomica, separata comunità microbiche risiedono nel lume e il rivestimento mucoso6. La comunità di lumen ha un accesso più diretto alle sostanze nutrienti come substrati spostare attraverso il vano luminal7. Nonostante questo, alcuni batteri risiedono preferenzialmente nello strato di muco, che utilizzano mucina prodotta dalle cellule del colon come un’energia fonte1,5,8. La differenza in microambienti tra i risultati di fasi luminal e delle mucose in divergenza e lo sviluppo di specifiche comunità di fase. Insieme, queste comunità forniscono funzioni metaboliche, come il metabolismo dei nutrienti e la produzione di vitamine e funzioni immunologiche, come prevenire la colonizzazione di agenti patogeni umani1,3, 9. il microbiota dell’intestino funziona anche funzionalmente in coniugazione con le cellule del colon umano3.
Come una parte importante di GIT umana, non è sorprendente che il microbiota dell’intestino è conosciuto per contribuire a entrambi host salute e malattia stato3,9,10,11,12. Un cambiamento nella popolazione microbica dell’intestino è stato associato con le malattie umane multiple, compreso i disordini GIT come malattia intestinale intestinale (IBD) e sindrome intestinale delle viscere (IBS), ma anche altre malattie, come l’obesità, malattie cardiovascolari e autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metaboliti prodotti dal microbiota dell’intestino hanno un effetto globale, raggiungendo posizioni lontano il budello12,13. Ad esempio, l’asse cervello-intestino è associata con disturbi mentali come ansia e depressione14. Pertanto, studiando il microbiota dell’intestino è importante a più campi di ricerca ed è applicabile a molte malattie, anche quelli non spesso associato con GIT.
Mentre è ampiamente riconosciuto che è importante studiare il microbiota dell’intestino, è uno sforzo complicato. Più modelli animali sono disponibili, da piccoli animali come zebrafish, ratti e topi, a quelle più grandi come scimmie e maiali15-19. Tuttavia, l’applicazione di questi animali in termini del microbiota dell’intestino umano è non è semplice, poiché questi animali hanno una singolare comunità batterica che si è evoluta basata su ambiente e dieta, e sono anatomicamente distinti da esseri umani20 , 21. l’uso di soggetti umani rimuove la questione della rilevanza ancora introduce un’altra serie di sfide. Gli studi umani sono costosi, che richiede tempo e sono eticamente vincolata11. Inoltre, fattori di confondimento influenzano il microbiota dell’intestino negli studi umani, tra cui età o fase inerente allo sviluppo, ambiente, dieta, farmaci e fattori genetici2,4,22. Ci sono anche restrizioni su ciò che può essere testato in esseri umani, e quale tipo di campioni può essere raccolto a cosa volte4.
Uno svantaggio critico dell’utilizzo di un sistema in vivo per studiare il microbiota dell’intestino è la presenza di componenti dei mammiferi. Il microbiota dell’intestino e le cellule umane interagiscono uno con l’altro, e in un in vivo l’impostazione, è impossibile distinguere i due. I metaboliti prodotti dal microbiota dell’intestino sono presi dalle cellule del colon, quindi misure non possono essere calcolate con precisione. Pertanto, qualsiasi studio meccanicistico deve limitarsi al punto finale misure11. Un altro grande svantaggio per studi in vivo è l’incapacità di raccogliere campioni provenienti da diverse regioni di GIT longitudinalmente23. Questo non consente per la valutazione dei cambiamenti che possono verificarsi in microambienti del colon nel tempo12. Molti in vivo studi, compreso gli studi umani, si basano sull’analisi di campioni di feci per rilevare le modifiche al microbiota intestinale12. Mentre questo è informativo, esso non fornisce dati sul microbiota dell’intestino attraverso GIT e non distingue tra le comunità luminal e mucosa5,6,7,8.
Per il microbiota dell’intestino, è necessaria l’applicazione di un metodo in vitro per studiare la dinamica della comunità batterica, senza interferenze da parte dei componenti dei mammiferi. Utilizzando un metodo in vitro permette un controllo stretto di condizioni ambientali10, prova di più parametri simultaneamente e l’abilità di campionare longitudinalmente e in grandi volumi11. Poiché un dispositivo meccanico e non un host utilizza un metodo in vitro, considerazioni non sono necessarie per età, ambiente, dieta o background genetico. Questi sistemi può essere utilizzato per verificare sia la comunità di microbiota dell’intestino intero, solo selezionati organismi, o addirittura singoli ceppi. D’importanza, i risultati in vitro sono riproducibili, ancora mantenere un livello di diversità paragonabile a studi in vivo11,22.
Secondo l’ipotesi in questione e i risultati desiderati, ion vitro studi possono essere eseguiti in diversi modi. Possono utilizzare sistemi del singolo-vaso e metodi semplici, quali incubando campioni con fecale omogeneato24 o l’esecuzione batch singolo colture nel corso di 24-48 h25. Essi può essere effettuate anche utilizzando sistemi del singolo-vaso e metodi più complessi, come l’utilizzo di un sistema di chemostat per produrre un intestino stabile comunità microbica11. Tuttavia, l’uso di un unico reattore può over-semplificare il microbiota12 poiché rappresenta solo una sezione del colon, anche se il colon è composto da regioni ascendente, trasversale e discendente.
Al fine di studiare la comunità di microbiota dell’intestino che si sviluppa nelle regioni differenti del colon (le regioni ascendente, trasversale e discendente), può essere impiegato un sistema complesso, multi-stadio. In questi sistemi, vasi multipli sono impostati per simulare le differenti regioni del colon, così il microbiota dell’intestino delle regioni ascendente, trasversale e discendente sono coltivati in modo indipendente. Questi vasi sono collegati, utilizzando pompe per spostare substrati in sequenza, dalla crescente a trasversale alle regioni del colon discendente, che imita il flusso delle sostanze nutrienti attraverso GIT.
L’obiettivo di questo studio era di dimostrare come un sistema di coltura in vitro di 5 stadi (Vedi Tabella materiali) può essere utilizzato per coltivare la comunità del microbiota dell’intestino e per dimostrare le dinamiche comunitarie in termini di stabilità e composizione. In questo sistema, una nave rappresenta lo stomaco e uno rappresentano l’intestino tenue. Il colon è diviso in tre regioni (ascendente, trasverso, discendente), con una nave che rappresenta ogni regione26. In questa messa a punto sperimentale, due sistemi completi sono stati eseguiti in parallelo, con l’unità 1 contenente i vettori di mucina a rappresenta la superficie mucosa e l’unità 2 non contenente nessun vettori di mucina. Le comunità che sviluppato nelle fasi di luminal e mucosa di ciascuna regione sono state confrontate a vicenda e per l’inoculo fecale nel tempo utilizzando analisi SCFA e gene del rRNA 16S. I risultati presentati dimostrano il tipo di comunità, sia in termini di composizione e funzionalità, che può essere prodotta da questo tipo di sistema in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistemi di coltura in vitro sono stati sviluppati per studiare il microbiota dell’intestino dell’intestino crasso. Essi utilizzano apparati progettati per simulare le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale, promuovendo la crescita di una comunità microbica intestinale maturo per ogni regione del colon33. Mentre il concetto è logico e comprensibile, l’esecuzione effettiva di sistemi di coltura in vitro per studiare il microbiota dell’intestino richiede precisione e una comprensione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sig. ra Audrey Thomas-Gavioli sono riconosciuto per la GC/MS funziona. Vorremmo anche ringraziare Massimo Marzorati per il manoscritto di editing.
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
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