Meget følsom måling af glomerulær permeabilitet hos mus med fluorescein isothiocyanat-polysakkarose 70
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at teste glomerulær permeabilitet i mus ved hjælp af en meget følsom, ikke-radioaktiv Tracer. Denne metode giver mulighed for gentagne urinanalyser med små urin volumener.
Abstract
Tabet af albumin i urinen (albuminuri) forudsiger kardiovaskulære udfald. Under fysiologiske forhold filtreres små mængder albumin af glomerulus og reabsorberes i det rørformede system indtil Absorptionsgrænsen nås. Tidlige stigninger i patologisk albumin filtrering kan således gå glip af ved at analysere albuminuria. Derfor er brugen af røbestoffer til at teste glomerulær permselektivitet synes fordelagtig. Fluorescently mærket Tracer fluorescein isothiocyanat (FITC)-polysakkarose (dvs., FITC-Ficoll), kan anvendes til at studere glomerulær permselektivitet. FITC-polysaccharosemolekyler filtreres frit af glomerulus, men ikke reabsorberes i det rørformede system. Hos mus og rotter er FITC-polysakkarose blevet undersøgt i modeller af glomerulær permeabilitet ved hjælp af teknisk komplekse procedurer (dvs. radioaktive målinger, højtydende væskekromatografi [HPLC], gel-filtrering). Vi har modificeret og lettet en FITC-polysakkarose Tracer-baserede protokol til at teste tidlige og små stigninger i glomerulær permeabilitet til FITC-polysakkarose 70 (størrelse af albumin) i mus. Denne metode muliggør gentagne urinanalyser med små urin volumener (5 μL). Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan Tracer FITC-polysaccharose 70 påføres intravenøst, og urin opsamles via et simpelt urin kateter. Urinen analyseres via en fluorescens plade læser og normaliseret til en urin koncentrations markør (kreatinin), hvorved man undgår teknisk komplekse procedurer.
Introduction
Funktionelle eller strukturelle defekter inden for den glomerulære filtrerings barriere øger glomerulær permeabilitet til albumin, hvilket resulterer i påvisning af albumin i urinen (albuminuri). Albuminuria forudsiger hjerte-kar-udfald og er en vigtig markør for glomerulær skade1. Selv lave niveauer af albuminuri, liggende inden for normalområdet, er forbundet med en øget kardiovaskulær risiko1.
Under fysiologiske forhold filtreres albumin gennem glomerulus og er næsten fuldstændigt genabsorberet i det rørformede system2,3. I mus udføres påvisning af albumin i urinen sædvanligvis af en albumin enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA) fra 24 timers urinopsamling. Hvis der anvendes urin fra en urinopsamling eller spot urin på 24 timer, kan små forskelle i albumin koncentrationer gå tabt på grund af analyse følsomheds problemer. De fleste forskere bruger derfor dyremodeller, hvor albuminuri induceres af robust nyreskade på grund af toksiner, narkotika og nyre kirurgi.
Derfor er konstateringen af en følsom metode til påvisning af små og forbigående ændringer i glomerulær permeabilitet meget vigtig for marken. Rippe et al. har præsenteret en rotte model til at teste glomerulær permeabilitet ved at anvende en fluorescently mærket Tracer, nemlig FITC-polysaccharose 70 (dvs., FITC-Ficoll 70), på størrelse med albumin4. Den Tracer ansøgning tillader afprøvning af kortsigtede ændringer i glomerulær permeabilitet (inden for minutter) og er meget følsom4. To undersøgelser har brugt Tracer-metoden i mus5,6. På trods af sine fordele, denne metode, desværre, har ulemper: det er teknisk meget komplekst, radioaktivt, og invasiv. Yderligere analyse af urinen opnås kun ved hjælp af gel filtrering eller størrelses udelukkelse HPLC5,6.
Inden for dette papir præsenterer vi en alternativ, følsom, ikke-radioaktiv og hurtig metode til at måle glomerulær permeabilitet i mus ved hjælp af fluorescently mærket FITC-polysaccharose 70. Ved at introducere et transuretral kateter er urin indsamlingen mindre invasiv end blære punktering, urethrotomi og suprapubisk kateter applikation, og giver mulighed for opsamling af urin mindst hver 30 min. urinanalyse udføres fra små mængder (5μl) ved hjælp af en fluorescerende plade læser. Spor koncentrationerne i urinen normaliseret til kreatinin koncentrationer i urinen ved hjælp af en enzymatisk kreatinin-analyse.
Derfor, denne nye metode tilbyder et følsomt værktøj til at studere tidlig glomerulær skade med øget glomerulær permeabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede metode gør det muligt for investigator at teste glomerulær permeabilitet i mus på en meget følsom måde ved hjælp af en Tracer. Med denne metode, kortsigtede stigninger i glomerulær permeabilitet kan diagnosticeres ved hjælp af kun små mængder af urin. De mest kritiske trin for vellykket mastering denne teknik er 1) udvikling af manuel ekspertise i mus kirurgi, især i kanylen af en central vene, 2) placering af urin kateteret uden at skade slimhinden, og 3) manuel ekspertise i håndtering 384-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, og Nicola Kuhr for deres ekstraordinære tekniske assistance og Dr. Dennis Sohn for hans hjælp med fluorescens scanningen. Denne forskning blev støttet af en bevilling af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 til L.C.R. og L.S. Funder havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
