Mesure très sensible de la perméabilité glomerulaire chez les souris avec fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour tester la perméabilité glomerulaire chez les souris à l’aide d’un traceur hautement sensible et non radioactif. Cette méthode permet des analyses d’urine répétitives avec de petits volumes d’urine.
Abstract
La perte d’albumine dans l’urine (albuminurie) prédit les résultats cardiovasculaires. Dans des conditions physiologiques, de petites quantités d’albumine sont filtrées par le glomerulus et réabsorbées dans le système tubulaire jusqu’à ce que la limite d’absorption soit atteinte. Les premières augmentations de la filtration pathologique de l’albumine peuvent, par conséquent, être manquées en analysant l’albuminurie. Par conséquent, l’utilisation de traceurs pour tester la permsélectivité glomerulaire semble avantageuse. L’isothiocyanate de fluorescéine étiqueté fluorescent (FITC)-polysucrose (c.-à-d., FITC-Ficoll), peut être employé pour étudier la permselectivité glomerulaire. Les molécules de FITC-polysucrose sont librement filtrées par le glomerulus mais ne sont pas réabsorbées dans le système tubulaire. Chez la souris et le rat, fitC-polysucrose a été étudié dans des modèles de perméabilité glomerulaire en utilisant des procédures techniquement complexes (c.-à-d., mesures radioactives, chromatographie liquide haute performance [HPLC], filtration de gel). Nous avons modifié et facilité un protocole basé sur le traceur FITC-polysucrose pour tester les augmentations précoces et petites de la perméabilité glomerulaire à FITC-polysucrose 70 (taille de l’albumine) chez les souris. Cette méthode permet des analyses d’urine répétitives avec de petits volumes d’urine (5 L). Ce protocole contient des informations sur la façon dont le traceur FITC-polysucrose 70 est appliqué par voie intraveineuse et l’urine est recueillie par l’intermédiaire d’un cathéter urinaire simple. L’urine est analysée par un lecteur de plaque de fluorescence et normalisée à un marqueur de concentration d’urine (créatinine), évitant ainsi des procédures techniquement complexes.
Introduction
Les défauts fonctionnels ou structurels dans la barrière de filtration glomerulaire augmentent la perméabilité glomerulaire à l’albumine, ayant pour résultat la détection de l’albumine dans l’urine (albuminuria). L’albuminurie prédit les résultats cardio-vasculaireset est un marqueur important pour des dommages glomerular 1. Même de faibles niveaux d’albuminurie, se trouvant dans la plage normale, sont associés à un risque cardio-vasculaire accru1.
Dans des conditions physiologiques, l’albumine est filtrée à travers le glomerulus et est presque entièrement réabsorbée dans le système tubulaire2,3. Chez la souris, la détection de l’albumine dans l’urine est habituellement effectuée par un essai immunosorbent lié à l’enzyme d’albumine (ELISA) à partir de 24 h de collecte d’urine. Si l’urine d’une collecte d’urine de 24 h ou de l’urine spot est utilisée, de petites différences dans les concentrations d’albumine peuvent être manquées en raison de problèmes de sensibilité à l’analyse. La plupart des chercheurs, par conséquent, utilisent des modèles animaux dans lesquels l’albuminurie est induite par des dommages rénaux robustes dus aux toxines, aux drogues, et à la chirurgie rénale.
Par conséquent, la découverte d’une méthode sensible pour détecter les changements petits et transitoires dans la perméabilité glomerulaire est très importante pour le domaine. Rippe et coll. ont présenté un modèle de rat pour tester la perméabilité glomerulaire en appliquant un traceur étiqueté fluorescent, à savoir FITC-polysucrose 70 (c.-à-d., FITC-Ficoll 70), à la taille de l’albumine4. L’application de traceur permet de tester les changements à court terme de la perméabilité glomerulaire (en quelques minutes) et est très sensible4. Deux études ont utilisé la méthode traceur chez les souris5,6. Malgré ses avantages, cette méthode présente malheureusement des inconvénients : elle est techniquement très complexe, radioactive et invasive. Une analyse plus approfondie de l’urine n’est effectuée qu’en utilisant la filtration de gel ou la taille-exclusion HPLC5,6.
Dans cet article, nous présentons une méthode alternative, sensible, non radioactive, et rapide pour mesurer la perméabilité glomerular chez les souris utilisant fluorescently étiqueté FITC-polysucrose 70. En introduisant un cathéter transurétral, la collecte d’urine est moins invasive que la perforation de la vessie, l’urérotomie et l’épétére suprapubienne, et permet la collecte d’urine au moins toutes les 30 min. L’analyse d’urine est effectuée à partir de petites quantités (5 l) à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes. Les concentrations de traceurs dans l’urine sont normalisées aux concentrations de créatinine dans l’urine à l’aide d’un test de créatinine enzymatique.
Par conséquent, cette nouvelle méthode offre un outil sensible pour étudier les dommages glomerulaires tôt avec la perméabilité glomerular accrue.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée permet à l’investigateur de tester la perméabilité glomerulaire chez la souris d’une manière très sensible à l’aide d’un traceur. Avec cette méthode, des augmentations à court terme de la perméabilité glomerulaire peuvent être diagnostiquées en utilisant seulement de petites quantités d’urine. Les étapes les plus critiques pour maîtriser avec succès cette technique sont 1) développer l’expertise manuelle dans la chirurgie de souris, particulièrement dans l’annulation d’une veine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Christina Schwandt, Blanka Duvnjak et Nicola Kuhr pour leur assistance technique exceptionnelle et le Dr Dennis Sohn pour son aide à l’analyse de la fluorescence. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 à L.C.R. et L.S. Le bailleur de rôle n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
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