Floresan Isotiyoyanat-polisucrose 70 ile Farelerde Glomerüler Geçirgenliğin Yüksek Hassas Ölçümü
Summary
Burada, farelerde çok hassas, radyoaktif olmayan bir izleyici kullanarak glomerüler geçirgenliği test etmek için bir protokol sıyoruz. Bu yöntem küçük idrar hacimleri ile tekrarlayan idrar analizleri sağlar.
Abstract
İdrarda albumin kaybı (albuminüri) kardiyovasküler sonucu tahmin eder. Fizyolojik koşullar altında, az miktarda albumin glomerulus tarafından süzülür ve emme sınırına ulaşıncaya kadar tübüler sistemde tekrar emilir. Patolojik albumin filtrasyonundaki erken artışlar albuminüri analiz edilerek gözden kaçabilir. Bu nedenle, glomerüler permselectivity test etmek için izleyicilerin kullanımı avantajlı görünür. Floresan etiketli tracer fluorescein izotiyoyanat (FITC)-polissökroz (yani, FITC-Ficoll), glomerüler permselectivity çalışma için kullanılabilir. FITC-polissucrose molekülleri glomerulus tarafından serbestçe süzülür, ancak boru sisteminde emilir. Fare ve sıçanlarda FITC-poliskroz, teknik olarak karmaşık prosedürler (yani radyoaktif ölçümler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi [HPLC], jel filtrasyon) kullanılarak glomerüler geçirgenlik modellerinde araştırılmıştır. Farelerde FITC-polysucrose 70 (albumin boyutu) glomerüler geçirgenlikte erken ve küçük artışları test etmek için FITC-polissucrose tracer tabanlı protokolü modifiye ettik ve kolaylaştırdık. Bu yöntem, küçük idrar hacimleri (5 μL) ile tekrarlayan idrar analizleri sağlar. Bu protokol, fitc-polisökroz 70’in intravenöz olarak nasıl uygulandığı ve basit bir idrar kateteri ile idrarın nasıl toplandığı hakkında bilgi içermektedir. İdrar bir floresan levha okuyucu ile analiz edilir ve bir idrar konsantrasyonu belirteci normalize (kreatinin), bu şekilde teknik olarak karmaşık prosedürler kaçınarak.
Introduction
Glomerüler filtrasyon bariyerindeki fonksiyonel veya yapısal bozukluklar glomerüler geçirgenliği arttırarak albümine (albuminüri) albumin saptanır. Albuminüri kardiyovasküler sonucu tahmin eder ve glomerüler yaralanma için önemli bir belirteçtir1. Hatta düşük albuminüri düzeyleri, normal aralıkta yalan, artmış kardiyovasküler risk ile ilişkilidir1.
Fizyolojik koşullar altında, albumin glomerulus yoluyla süzülür ve neredeyse tamamenboru sistemi 2,3emilir . Farelerde, idrarda albumin tespiti genellikle idrar toplama 24 saat bir albumin enzim bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) tarafından yapılır. 24 saat idrar toplama veya spot idrardan idrar kullanılırsa, taht hassasiyeti problemleri nedeniyle albümin konsantrasyonlarında küçük farklılıklar gözden kaçabilir. Çoğu araştırmacı, bu nedenle, hangi albuminüri toksinler, ilaçlar ve böbrek cerrahisi nedeniyle sağlam böbrek hasarı ile indüklenen hayvan modelleri kullanın.
Bu nedenle glomerüler geçirgenlikteki küçük ve geçici değişiklikleri saptamak için hassas bir yöntemin bulunması alan için çok önemlidir. Rippe ve ark. bir floresan etiketli tracer uygulayarak glomerüler geçirgenliği test etmek için bir sıçan modeli sunduk, yani FITC-polysucrose 70 (yani, FITC-Ficoll 70), albumin boyutunda4. Tracer uygulaması glomerüler geçirgenlik kısa vadeli değişikliklerin test sağlar (dakika içinde) ve çok hassas4. İki çalışmada farelerde izleme yöntemi kullanılmıştır5,6. Faydalarına rağmen, bu yöntem, ne yazık ki, dezavantajları vardır: teknik olarak çok karmaşık, radyoaktif, ve invaziv. İdrar ın daha fazla analizi sadece jel filtrasyon veya boyut dışlama HPLC5,6kullanılarak gerçekleştirilir.
Bu yazıda, floresan fitc-polissucrose 70 etiketli farelerde glomerüler geçirgenliği ölçmek için alternatif, hassas, radyoaktif olmayan ve hızlı bir yöntem salıyoruz. Transüretral kateter getirilerek, idrar toplama mesane delinmesi, üretrotomi ve suprapubik kateter uygulamasına göre daha az invazivdir ve idrar ın en az her 30 dakikada bir (5°L) kullanılarak idrar toplamasına izin verir. floresan plaka okuyucu. İdrarda tracer konsantrasyonları enzimatik kreatinin testi kullanılarak idrardaki kreatinin konsantrasyonlarına normalleşir.
Bu nedenle, bu yeni yöntem artmış glomerüler geçirgenlik ile erken glomerüler yaralanma çalışma için hassas bir araç sunuyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan yöntem, araştırmacının farelerde glomerüler geçirgenliği çok hassas bir şekilde bir izleyici kullanarak test etmesini sağlar. Bu yöntemle glomerüler geçirgenlikte kısa süreli artışlar sadece az miktarda idrar kullanılarak teşhis edilebilir. Bu tekniği başarılı bir şekilde ustalaşmak için en kritik adımlar 1) fare cerrahisinde manuel uzmanlık geliştirmek, özellikle merkezi bir damarın kanülasyonunda, 2) idrar kateterini mukozaya zarar vermeden yerleştirmek ve 3) elle işleme de ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Christina Schwandt, Blanka Duvnjak ve Nicola Kuhr onların olağanüstü teknik yardım ve Dr Dennis Sohn floresan tarama ile yaptığı yardım için teşekkür ederiz. Bu araştırma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18’in L.C.R. ve L.S. için verdiği bir hibe ile desteklenmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
