Zeer gevoelige meting van de glomerulaire permeabiliteit bij muizen met Fluorescein isothiocyanaat-poly sucrose 70
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het testen van de glomerulaire permeabiliteit in muizen met behulp van een zeer gevoelige, niet-radioactieve Tracer. Deze methode maakt repetitieve urine analyses mogelijk met kleine urine volumes.
Abstract
Het verlies van albumine in de urine (albuminurie) voorspelt cardiovasculaire uitkomst. Onder fysiologische omstandigheden worden kleine hoeveelheden albumine gefilterd door de glomerulus en weer geabsorbeerd in het buis systeem tot de absorptie limiet is bereikt. Vroege verhogingen van pathologische albumine filtratie kunnen dus worden gemist door het analyseren van albuminurie. Daarom lijkt het gebruik van tracers voor het testen van glomerulaire permselectiviteit voordelig. Fluorescently gelabeld Tracer fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-poly sucrose (d.w.z. FITC-Ficoll), kan worden gebruikt om glomerulaire permselectiviteit te bestuderen. FITC-poly sucrose moleculen worden vrij gefilterd door de glomerulus maar niet geabsorbeerd in het buis systeem. Bij muizen en ratten is FITC-poly sucrose onderzocht in modellen van glomerulaire permeabiliteit door gebruik te maken van technisch complexe procedures (d.w.z. radioactieve metingen, hogedrukvloeistofchromatografie [HPLC], gel filtratie). We hebben een FITC-polysucrose Tracer-gebaseerd protocol aangepast en vergemakkelijkt om vroege en kleine stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit te testen op FITC-poly sucrose 70 (grootte van albumine) bij muizen. Deze methode maakt repetitieve urine analyses mogelijk met kleine urine volumes (5 μL). Dit protocol bevat informatie over hoe de Tracer FITC-poly sucrose 70 intraveneus wordt aangebracht en urine wordt opgevangen via een eenvoudige urinaire katheter. Urine wordt geanalyseerd via een fluorescentie plaat lezer en genormaliseerd naar een urine concentratie marker (creatinine), waardoor technisch complexe procedures te vermijden.
Introduction
Functionele of structurele defecten binnen de glomerulaire filtratie barrière verhogen glomerulaire permeabiliteit aan albumine, wat resulteert in de detectie van albumine in de urine (albuminurie). Albuminurie voorspelt cardiovasculaire uitkomst en is een belangrijke marker voor glomerulaire letsel1. Zelfs lage niveaus van albuminurie, liggend binnen het normale bereik, worden geassocieerd met een verhoogd cardiovasculair risico1.
Onder fysiologische omstandigheden, wordt albumine gefilterd door de glomerulus en wordt bijna volledig geabsorbeerd in het buisvormige systeem2,3. Bij muizen wordt de detectie van albumine in de urine gewoonlijk uitgevoerd door een albumine-enzym-gebonden immunosorptie test (ELISA) van 24 uur urine verzameling. Als urine uit een urine verzameling van 24 uur of spot urine wordt gebruikt, kunnen kleine verschillen in albumine concentraties worden gemist als gevolg van gevoeligheids problemen. De meeste onderzoekers gebruiken daarom diermodellen waarin albuminurie wordt geïnduceerd door robuuste nierschade als gevolg van toxines, drugs en nierchirurgie.
Daarom is de bevinding van een gevoelige methode voor het detecteren van kleine en voorbijgaande veranderingen in de glomerulaire permeabiliteit zeer belangrijk voor het veld. Rippe et al. hebben een rat-model gepresenteerd om de glomerulaire permeabiliteit te testen door een fluorescently gelabelde Tracer toe te passen, namelijk FITC-polysucrose 70 (d.w.z. FITC-Ficoll 70), op de grootte van albumine4. De Tracer applicatie maakt het testen van korte termijn veranderingen in glomerulaire permeabiliteit (binnen minuten) en is zeer gevoelig4. Twee studies hebben de Tracer methode gebruikt bij muizen5,6. Ondanks de voordelen heeft deze methode helaas nadelen: het is technisch zeer complex, radioactief en invasief. Verdere analyse van de urine wordt alleen bereikt door het gebruik van gel filtratie of grootte-uitsluiting HPLC5,6.
In dit document presenteren we een alternatieve, gevoelige, niet-radioactieve en snelle methode om de glomerulaire permeabiliteit bij muizen te meten met fluorescently gelabelde FITC-polysucrose 70. Door de invoering van een transurethrale katheter, urine inzameling is minder invasief dan blaas punctie, urethrotomie, en suprapubische katheter toepassing, en laat urine inzameling ten minste elke 30 min. urine analyse wordt uitgevoerd vanuit kleine hoeveelheden (5μL) met fluorescerende plaat lezer. Tracer concentraties in de urine worden genormaliseerd naar creatinine concentraties in de urine met behulp van een enzymatische creatinine test.
Daarom biedt deze nieuwe methode een gevoelig hulpmiddel om vroege glomerulaire letsels te bestuderen met verhoogde glomerulaire permeabiliteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde methode stelt de onderzoeker in staat om de glomerulaire permeabiliteit bij muizen op een zeer gevoelige manier te testen met behulp van een Tracer. Met deze methode, op korte termijn stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit kan worden gediagnosticeerd met behulp van slechts kleine hoeveelheden urine. De meest kritieke stappen voor het succesvol beheersen van deze techniek zijn 1) ontwikkeling van handmatige expertise in muis chirurgie, vooral in de cannulatie van een centrale ader, 2) het plaatsen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Christina Schwandt, Blanka Duvnjak en Nicola Kuhr voor hun uitzonderlijke technische assistentie en Dr. Dennis Sohn voor zijn hulp bij de fluorescentie scan. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP b18 tot L.C.R. en L.S. De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
