플루오레세인 이소티오차네이트-폴리수크로오스 70을 가진 마우스에서 사구체 투과성의 고감도 측정
Summary
여기에서, 우리는 고과민성, 비방사성 추적자를 사용하여 마우스에 있는 사구체 투과성을 시험하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 작은 소변 볼륨을 가진 반복적인 소변 분석을 허용합니다.
Abstract
소변에 있는 알부민의 손실 (알부민뇨) 심장 혈관 결과를 예측합니다. 생리적 조건하에서, 소량의 알부민은 사구체에 의해 여과되고 흡수 한계에 도달 할 때까지 관 시스템에서 재흡수됩니다. 병리학 적인 알부민의 초기 증가따라서, 알부민뇨증을 분석해서 놓칠 수 있습니다. 따라서 사구체 파면을 테스트하기 위해 트레이서를 사용하는 것이 유리해 보입니다. 형광 표지된 트레이서 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC)-폴리수크로오스(즉, FITC-Ficoll)는 사구체 파면선택성을 연구하는데 사용될 수 있다. FITC-폴리수크로오스 분자는 사구체에 의해 자유롭게 여과되지만 관형 시스템에서 재흡수되지 는 않습니다. 마우스 및 래트에서 FITC-polysucrose는 기술적으로 복잡한 절차 (즉, 방사성 측정, 고성능 액체 크로마토그래피 [HPLC], 겔 여과)를 사용하여 사구체 투과성의 모델에서 조사되었습니다. 우리는 마우스에서 FITC-polysucrose 70 (알부민의 크기)에 사구 체 투과성의 초기 및 작은 증가를 테스트하기 위해 FITC-polysucrose 추적자 기반 프로토콜을 수정하고 촉진했습니다. 이 방법은 작은 소변 볼륨 (5 μL)을 가진 반복적인 소변 분석을 허용합니다. 이 프로토콜은 트레이서 FITC-polysucrose 70이 정맥내 적용되고 소변이 간단한 오줌 카테터를 통해 집합되는 방법에 대한 정보를 포함합니다. 소변은 형광 판 리더를 통해 분석하고 소변 농도 마커 (크레아티닌)로 정규화되어 기술적으로 복잡한 절차를 피합니다.
Introduction
사구 여과 장벽 내의 기능적 또는 구조적 결함은 알부민에 사구체 투과성을 증가시켜 소변에서 알부민 (알부민뇨)을 검출합니다. 알부민뇨아는 심혈관 결과를 예측하고 사구체 부상에 대한 중요한 마커입니다1. 알부민뇨증의 낮은 수준조차도 정상 범위 내에 놓여있으며 심장 혈관 위험 증가와 관련이있습니다 1.
생리적 조건하에서, 알부민은 사구체를 통해 여과되고 관 계통2,3에서거의 완전히 재흡수됩니다. 마우스에서, 소변에 있는 알부민의 검출은 일반적으로 소변 수집의 24 시간에서 알부민 효소 연결된 면역 흡착 분석 (ELISA)에 의해 수행됩니다. 24 시간 소변 수집 또는 반점 소변에서 소변을 사용하는 경우, 알부민 농도의 작은 차이는 분석 감도 문제로 인해 놓칠 수 있습니다. 대부분의 연구원은, 그러므로, 독소, 약 및 신장 수술 때문에 강력한 신장 상해에 의해 알부민뇨가 유도되는 동물 모형을 이용합니다.
따라서 사구 체 투과성의 작고 일시적인 변화를 감지하는 민감한 방법의 발견은 현장에서 매우 중요합니다. Rippe 등은 알부민4의크기로 형광 표지 된 트레이서, 즉 FITC-폴리 수크로오스 70 (즉, FITC-Ficoll 70)을 적용하여 사구체 투과성을 테스트하는 랫트 모델을 제시했습니다. 추적 응용 프로그램은 사구 체 투과성의 단기 변화를 테스트 할 수 있습니다 (분 이내) 매우 민감한4. 2건의 연구에서는 마우스5,6에서트레이서 방법을 사용하였다. 그 이점에도 불구하고,이 방법은 불행히도 기술적으로 매우 복잡하고 방사능및 침습적이라는 단점이 있습니다. 소변의 추가 분석은 겔 여과 또는 크기 배제 HPLC5,6을사용하여 수행된다.
이 논문에서, 우리는 형광으로 표지된 FITC-polysucrose 70를 사용하여 마우스에 있는 사구 체 투과성을 측정하는 대안, 과민한, 비방사성 및 빠른 방법을 제시합니다. 요도 카테터를 도입함으로써, 소변 수집은 방광 천자, 요도 절제술 및 상피 카테터 적용보다 덜 침습적이며, 적어도 30 분마다 소변 수집을 허용합니다. 형광 플레이트 리더. 소변에 있는 추적자 농도효소 크레아티닌 분석술을 사용하여 소변에 있는 크레아티닌 농도로 정규화됩니다.
따라서, 이 새로운 방법은 증가 사구 체 투과성 초기 사구체 부상을 연구하는 민감한 도구를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 방법은 조사자가 추적자를 사용하여 매우 민감한 방식으로 마우스의 사구 체 투과성을 테스트 할 수 있게합니다. 이 방법을 사용하면 소량의 소변만 사용하여 사구 체 투과성의 단기 증가를 진단 할 수 있습니다. 이 기술을 성공적으로 마스터하기 위한 가장 중요한 단계는 1) 마우스 수술, 특히 중앙 정맥의 통조림, 2) 점막에 해를 끼치지 않고 오줌 카테터를 배치하는 수동 전문 지식 개발, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 뛰어난 기술 지원에 대해 크리스티나 슈반트, 블랭카 듀벤작, 니콜라 쿠어에게 감사를 표하고, 데니스 손 박사는 형광 스캔에 도움을 주었습니다. 이 연구는 도이치 포충스게마인샤프트(DFG) SFB 612 TP B18을 L.C.R. 및 L.S에 부여하여 지원되었다. 자금 은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었다.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
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