Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para probar la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador no radioactivo altamente sensible. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina.
Abstract
La pérdida de albúmina en la orina (albuminuria) predice el resultado cardiovascular. En condiciones fisiológicas, pequeñas cantidades de albúmina son filtradas por el glomérulo y reabsorbidas en el sistema tubular hasta que se alcanza el límite de absorción. Los primeros aumentos en la filtración patológica de albúmina pueden, por lo tanto, perderse mediante el análisis de la albúmina. Por lo tanto, el uso de trazadores para probar la permselectividad glomerular parece ventajoso. El trazador fluorescentemente etiquetado isotiocianato de fluoresceína (FITC)-polisucrosa (es decir, FITC-Ficoll), se puede utilizar para estudiar la permselectividad glomerular. Las moléculas FITC-polisucrosa son filtradas libremente por el glomérulo pero no reabsorbidas en el sistema tubular. En ratones y ratas, FITC-policrorosa se ha investigado en modelos de permeabilidad glomerular mediante el uso de procedimientos técnicamente complejos (es decir, mediciones radiactivas, cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC], filtración de gel). Hemos modificado y facilitado un protocolo basado en trazador de policrorosa FITC para probar aumentos tempranos y pequeños en la permeabilidad glomerular a FITC-policrorosa 70 (tamaño de la albúmina) en ratones. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina (5 l). Este protocolo contiene información sobre cómo se aplica por vía intravenosa el trazador FITC-policrorosa 70 y la orina se recoge a través de un simple catéter urinario. La orina se analiza a través de un lector de placas de fluorescencia y se normaliza a un marcador de concentración de orina (creatinina), evitando así procedimientos técnicamente complejos.
Introduction
Los defectos funcionales o estructurales dentro de la barrera de filtración glomerular aumentan la permeabilidad glomerular a la albúmina, lo que resulta en la detección de albúmina en la orina (albuminuria). La albúmina predice el resultado cardiovascular y es un marcador importante para la lesión glomerular1. Incluso los niveles bajos de albúmina, que se encuentran dentro del rango normal, se asocian con un aumento del riesgo cardiovascular1.
En condiciones fisiológicas, la albúmina se filtra a travésdel glomérulo y se reabsorbe casi por completo en el sistema tubular 2,3. En ratones, la detección de albúmina en la orina suele realizarse mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de albúmina (ELISA) a partir de las 24 horas de recolección de orina. Si se utiliza orina de una colección de orina de 24 horas o orina manchada, se pueden perder pequeñas diferencias en las concentraciones de albúmina debido a problemas de sensibilidad al ensayo. La mayoría de los investigadores, por lo tanto, utilizan modelos animales en los que la albuminuria es inducida por una lesión renal robusta debido a toxinas, medicamentos y cirugía renal.
Por lo tanto, la búsqueda de un método sensible para detectar pequeños y transitorios cambios en la permeabilidad glomerular es muy importante para el campo. Rippe et al. han presentado un modelo de rata para probar la permeabilidad glomerular mediante la aplicación de un trazador con etiqueta fluorescente, a saber, FITC-polisucrose 70 (es decir, FITC-Ficoll 70), en el tamaño de la albúmina4. La aplicación de trazador permite la prueba de cambios a corto plazo en la permeabilidad glomerular (en cuestión de minutos) y es muy sensible4. Dos estudios han utilizado elmétodo trazador en ratones 5,6. A pesar de sus beneficios, este método, por desgracia, tiene desventajas: es técnicamente muy complejo, radiactivo e invasivo. El análisis posterior de la orina sólo se realiza mediante el uso de filtración de gel o tamaño-exclusión HPLC5,6.
Dentro de este artículo, presentamos un método alternativo, sensible, no radioactivo y rápido para medir la permeabilidad glomerular en ratones utilizando fluorescentemente etiquetado FITC-policrorosa 70. Mediante la introducción de un catéter transuretral, la recolección de orina es menos invasiva que la punción vesical, la uretrotomía y la aplicación de catéter suprapúbico, y permite la recolección de orina al menos cada 30 minutos. El análisis de orina se realiza a partir de pequeñas cantidades (5 ol) utilizando un lector de placas fluorescentes. Las concentraciones de trazador en la orina se normalizan a las concentraciones de creatinina en la orina mediante un ensayo de creatinina enzimática.
Por lo tanto, este novedoso método ofrece una herramienta sensible para estudiar lesiones glomerulares tempranas con mayor permeabilidad glomerular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado permite al investigador probar la permeabilidad glomerular en ratones de una manera muy sensible utilizando un trazador. Con este método, los aumentos a corto plazo en la permeabilidad glomerular se pueden diagnosticar utilizando sólo pequeñas cantidades de orina. Los pasos más críticos para dominar con éxito esta técnica son 1) el desarrollo de la experiencia manual en cirugía de ratón, especialmente en la cannulación de una vena central, 2) la colocación del catéter urinario sin dañar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Christina Schwandt, Blanka Duvnjak y Nicola Kuhr por su excepcional asistencia técnica y al Dr. Dennis Sohn por su ayuda con el escaneo de fluorescencia. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 a L.C.R. y L.S. El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
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