Hochempfindliche Messung der Glomerularpermeabilität bei Mäusen mit Fluorescein-Isothiocyanat-Polysukrose 70
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen mit einem hochempfindlichen, nicht radioaktiven Tracer vor. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina.
Abstract
Der Verlust von Albumin im Urin (Albuminurie) sagt kardiovaskuläres Ergebnis voraus. Unter physiologischen Bedingungen werden kleine Mengen von Albumin durch den Glomerulus gefiltert und im Röhrensystem bis zum Erreichen der Absorptionsgrenze resorbiert. Frühe Zunahmen der pathologischen Albuminfiltration können daher durch die Analyse von Albuminurie übersehen werden. Daher erscheint die Verwendung von Tracern zur Prüfung der glomerulären Permselektivität vorteilhaft. Fluoreszierend markierte Tracer fluorescein isothiocyanat (FITC)-Polysucrose (d.h. FITC-Ficoll) kann verwendet werden, um die glomeruläre Permselektivität zu untersuchen. FITC-Polysucrose-Moleküle werden durch den Glomerulus frei gefiltert, aber nicht im Röhrensystem resorbiert. Bei Mäusen und Ratten wurde FITC-Polysucrose in Modellen der glomerulären Permeabilität mit technisch komplexen Verfahren (d. h. radioaktive Messungen, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [HPLC], Gelfiltration) untersucht. Wir haben ein AUF FITC-Polysucrose Tracer basierendes Protokoll modifiziert und erleichtert, um frühe und geringfügige Erhöhungen der glomerulären Permeabilität zu FITC-Polysukrose 70 (Größe von Albumin) bei Mäusen zu testen. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina (5 l). Dieses Protokoll enthält Informationen darüber, wie der Tracer FITC-Polysukrose 70 intravenös aufgetragen und Urin über einen einfachen Harnkatheter gesammelt wird. Urin wird über einen Fluoreszenzplattenleser analysiert und zu einem Urinkonzentrationsmarker (Kreatinin) normalisiert, wodurch technisch komplexe Verfahren vermieden werden.
Introduction
Funktionelle oder strukturelle Defekte innerhalb der glomerulären Filtrationsbarriere erhöhen die glomeruläre Durchlässigkeit gegenüber Albumin, was zur Detektion von Albumin im Urin (Albuminurie) führt. Albuminuria sagt kardiovaskuläres Ergebnis voraus und ist ein wichtiger Marker für glomeruläre Verletzungen1. Selbst niedrige Niveaus von Albuminurie, die im normalen Bereich liegen, sind mit einem erhöhten kardiovaskulären Risikoverbunden 1.
Unter physiologischen Bedingungen wird Albumin durch den Glomerulus gefiltert und fast vollständig im Röhrensystem2,3resorbiert. Bei Mäusen wird der Nachweis von Albumin im Urin in der Regel durch einen Albumin-Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) aus 24 h Urinsammlung durchgeführt. Wenn Urin aus einer 24 h Urinsammlung oder Spot-Urin verwendet wird, können kleine Unterschiede in den Albumin-Konzentrationen aufgrund von Assay-Empfindlichkeitsproblemen übersehen werden. Die meisten Forscher verwenden daher Tiermodelle, in denen Albuminurie durch robuste Nierenverletzungen durch Toxine, Medikamente und Nierenoperationen induziert wird.
Daher ist die Suche nach einer sensiblen Methode zur Erkennung kleiner und vorübergehender Veränderungen der glomerulären Permeabilität für das Feld sehr wichtig. Rippe et al. haben ein Rattenmodell zur Prüfung der glomerulären Permeabilität vorgelegt, indem sie einen fluoreszierend beschrifteten Tracer, nämlich FITC-Polysukrose 70 (d.h. FITC-Ficoll 70), in der Größe von Albumin4auftragen. Die Tracer-Anwendung ermöglicht die Prüfung von kurzfristigen Veränderungen der glomerulären Permeabilität (innerhalb von Minuten) und ist sehr empfindlich4. Zwei Studien haben die Tracer-Methode bei Mäusen5,6verwendet. Trotz ihrer Vorteile hat diese Methode leider Nachteile: Sie ist technisch sehr komplex, radioaktiv und invasiv. Eine weitere Analyse des Urins erfolgt nur durch Gelfiltration oder Größenausschluss HPLC5,6.
In diesem Beitrag stellen wir eine alternative, empfindliche, nicht radiozentrische und schnelle Methode zur Messung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen mit fluoreszierend beschriftetem FITC-Polysukrose 70 vor. Durch die Einführung eines transurethralen Katheters ist die Urinsammlung weniger invasiv als Blasenpunktion, Urethrotomie und suprapubische Katheteranwendung und ermöglicht eine Urinsammlung mindestens alle 30 min. Die Urinanalyse wird aus kleinen Mengen (5 fluoreszierenden Plattenleser. Tracer-Konzentrationen im Urin werden mit einem enzymatischen Kreatinin-Assay zu Kreatininkonzentrationen im Urin normalisiert.
Daher bietet diese neuartige Methode ein empfindliches Werkzeug, um frühe glomeruläre Verletzungen mit erhöhter glomerulärer Permeabilität zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Methode ermöglicht es dem Prüfer, die glomeruläre Permeabilität bei Mäusen auf sehr empfindliche Weise mit einem Tracer zu testen. Mit dieser Methode kann eine kurzfristige Erhöhung der glomerulären Permeabilität mit nur geringen Mengen Urin diagnostiziert werden. Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Beherrschung dieser Technik sind 1) die Entwicklung manueller Expertise in der Mauschirurgie, insbesondere in der Kanulation einer zentralen Vene, 2) Platzierung des Harnkatheters ohne Beei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Christina Schwandt, Blanka Duvnjak und Nicola Kuhr für ihre außergewöhnliche technische Unterstützung und Dr. Dennis Sohn für seine Hilfe beim Fluoreszenzscan. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 an L.C.R. und L.S. unterstützt. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
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