Misurazione altamente sensibile della permeabilità glomerare nei topi con Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per testare la permeabilità glomerare nei topi utilizzando un tracciante altamente sensibile e non radioattivo. Questo metodo consente analisi ripetitive delle urine con piccoli volumi di urina.
Abstract
La perdita di albumina nelle urine (albuminuria) predice l’esito cardiovascolare. In condizioni fisiologiche, piccole quantità di albumina vengono filtrate dal glomerulus e riassorbite nel sistema tubolare fino al raggiungimento del limite di assorbimento. I primi aumenti nella filtrazione dell’albumina patologica possono, quindi, essere persi analizzando l’albuminuria. Pertanto, l’uso di traccianti per testare la permselettività glomerare appare vantaggioso. Fluorescentemente etichettato tracer fluoresceinisociocionanato (FITC)-polisucrosi (cioè FITC-Ficoll), può essere utilizzato per studiare la permselettività glomerare. Le molecole di fitC-polisucrosi vengono liberamente filtrate dal glomerulus ma non riassorbite nel sistema tubolare. Nei topi e nei ratti, la polisucrosi FITC è stata studiata in modelli di permeabilità glomerare utilizzando procedure tecnicamente complesse (ad esempio, misurazioni radioattive, cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC], filtrazione del gel). Abbiamo modificato e facilitato un protocollo basato su tracciante FITC-polysucrosi per testare precoce e piccoli aumenti della permeabilità glomerare al polidiagnosi DI FITC 70 (dimensioni dell’albumina) nei topi. Questo metodo consente analisi ripetitive delle urine con piccoli volumi di urina (5 o L). Questo protocollo contiene informazioni su come il tracciante FITC-polysucrose 70 viene applicato per via endovenosa e l’urina viene raccolta attraverso un semplice catetere urinario. L’urina viene analizzata tramite un lettore di piastra di fluorescenza e normalizzata in un marcatore di concentrazione delle urine (creatinina), evitando così procedure tecnicamente complesse.
Introduction
I difetti funzionali o strutturali all’interno della barriera di filtrazione glomeulare aumentano la permeabilità glomerare all’albumina, con conseguente individuazione dell’albumina nelle urine (albuminuria). Albuminuria predice l’esito cardiovascolare ed è un marcatore importante per lesioni glomeriule1. Anche bassi livelli di albuminuria, che si trovano all’interno della gamma normale, sono associati ad un aumento del rischio cardiovascolare1.
In condizioni fisiologiche, l’albumina viene filtrata attraverso il glomerulus ed è quasi completamente riassorbita nel sistema tubolare2,3. Nei topi, il rilevamento dell’albumina nelle urine è di solito eseguita da un saggio immunosorbent legato agli enzimi (ELISA) da 24 h di raccolta delle urine. Se si usa l’urina di una raccolta di urina di 24 ore o di un’urina spot, piccole differenze nelle concentrazioni di albumine possono essere perse a causa di problemi di sensibilità all’analisi. La maggior parte dei ricercatori, quindi, utilizza modelli animali in cui l’albuminuria è indotta da robuste lesioni renali a causa di tossine, farmaci e chirurgia renale.
Pertanto, la scoperta di un metodo sensibile per rilevare piccoli e transitori cambiamenti nella permeabilità glomerare è molto importante per il campo. Rippe et al. hanno presentato un modello di ratto per testare la permeabilità glomerare applicando un tracciante fluorescente, vale a dire FITC-polysucrose 70 (cioè FITC-Ficoll 70), con le dimensioni dell’albumina4. L’applicazione tracer consente di testare le modifiche a breve termine nella permeabilità glomerare (in pochi minuti) ed è molto sensibile4. Due studi hanno utilizzato il metodo del tracciante nei topi5,6. Nonostante i suoi benefici, questo metodo, purtroppo, ha svantaggi: è tecnicamente molto complesso, radioattivo e invasivo. Ulteriori analisi delle urine viene effettuata solo utilizzando la filtrazione in gel o l’esclusione delle dimensioni HPLC5,6.
All’interno di questo documento, presentiamo un metodo alternativo, sensibile, non radioattivo e veloce per misurare la permeabilità glomerare nei topi utilizzando fluorescentmente etichettato FITC-polysucrose 70. Con l’introduzione di un catetere transuretrale, la raccolta delle urine è meno invasiva della puntura della vescica, dell’uretrotomia e dell’applicazione del catetere soprapubico e consente la raccolta delle urine almeno ogni 30 min. lettore di piastre fluorescenti. Le concentrazioni di traccianti nelle urine sono normalizzate alle concentrazioni di creatinina nelle urine utilizzando un saggio di creatinina enzimatico.
Pertanto, questo nuovo metodo offre uno strumento sensibile per studiare le lesioni più precoci glomerari con una maggiore permeabilità glomerare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo presentato consente allo sperimentatore di testare la permeabilità glomerare nei topi in modo molto sensibile utilizzando un tracciante. Con questo metodo, aumenti a breve termine nella permeabilità glomerare possono essere diagnosticati utilizzando solo piccole quantità di urina. I passaggi più critici per padroneggiare con successo questa tecnica sono 1) lo sviluppo di competenze manuali nella chirurgia del mouse, soprattutto nella concanulazione di una vena centrale, 2) ponendo il catetere urinario senza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Christina Schwandt, Blanka Duvnjak e Nicola Kuhr per l’eccezionale assistenza tecnica e il dottor Dennis Sohn per il suo aiuto nella scansione della fluorescenza. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 a L.C.R. e L.S. Il funder non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
