Mycket känslig mätning av glomerulär permeabilitet hos möss med fluorescein isotiocyanat-polysackaros 70
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att testa glomerulär permeabilitet hos möss med en mycket känslig, icke-radioaktivt spårämne. Denna metod möjliggör repetitiva urin analyser med små urin volymer.
Abstract
Förlusten av albumin i urinen (albuminuri) förutspår kardiovaskulära resultat. Under fysiologiska förhållanden, små mängder av albumin filtreras av Glomerulus och återabsorberas i det tubulära systemet upp tills Absorptionsgränsen uppnås. Tidiga ökningar i patologisk albumin filtrering kan därför missas genom att analysera albuminuri. Därför förefaller det fördelaktigt att använda spårämnen för att testa glomerulär permselektivitet. Fluorescent märkt Tracer fluorescein isotiocyanat (FITC)-polysackaros (dvs FITC-Ficoll), kan användas för att studera glomerulär permselektivitet. FITC-polysackaromolekyler filtreras fritt av Glomerulus men inte återabsorberas i det rörformiga systemet. Hos möss och råttor har FITC-polysackaros undersökts i modeller av glomerulär permeabilitet genom att använda tekniskt komplexa procedurer (dvs. radioaktiva mätningar, vätskekromatografi med hög prestanda [HPLC], gelfiltrering). Vi har modifierat och underlättat en FITC-polysackarospårningsbaserade protokoll för att testa tidiga och små ökningar i glomerulär permeabilitet för FITC-polysackaros 70 (storlek av albumin) hos möss. Denna metod möjliggör repetitiva urin analyser med små urin volymer (5 μL). Detta protokoll innehåller information om hur tracerfitc-polysackaros 70 appliceras intravenöst och urin samlas in via en enkel urinkateter. Urin analyseras via en fluorescens-Plattläsare och normaliseras till en urin koncentrations markör (kreatinin), vilket undviker tekniskt komplicerade procedurer.
Introduction
Funktionella eller strukturella defekter inom den glomerulära filtrerings barriären ökar glomerulär permeabilitet för albumin, vilket resulterar i detektion av albumin i urinen (albuminuri). Albuminuria förutspår kardiovaskulära resultat och är en viktig markör för glomerulär skada1. Även låga nivåer av albuminuri, liggande inom det normala intervallet, är förknippade med en ökad kardiovaskulär risk1.
Under fysiologiska förhållanden, albumin filtreras genom Glomerulus och är nästan helt återabsorberas i det rörformiga systemet2,3. Hos möss utförs detekteringen av albumin i urinen vanligen genom ett albuminenzymlänkat immunosorbent-test (ELISA) från 24 timmar urin uppsamling. Om urin från en 24 h urin insamling eller plats urin används, små skillnader i albuminkoncentrationer kan missas på grund av assay känslighet problem. De flesta forskare, därför, använda djurmodeller där albuminuri induceras av robust njurskada på grund av toxiner, droger, och njur kirurgi.
Därför är konstaterandet av en känslig metod för att upptäcka små och övergående förändringar i glomerulär permeabilitet mycket viktigt för området. Rippe et al. har presenterat en råtta-modell för att testa glomerulär permeabilitet genom att tillämpa en Fluorescent märkt Tracer, nämligen FITC-polysackaros 70 (dvs FITC-Ficoll 70), i storlek med albumin4. Tracerapplikationen möjliggör testning av kortsiktiga förändringar i glomerulär permeabilitet (inom några minuter) och är mycket känslig4. Två studier har använt spår metoden i möss5,6. Trots dess fördelar, denna metod, tyvärr, har nackdelar: det är tekniskt mycket komplexa, radioaktiva, och invasiva. Ytterligare analys av urinen är endast åstadkommas med hjälp av gelfiltrering eller storlek-uteslutning HPLC5,6.
I detta dokument presenterar vi en alternativ, känslig, icke-radioaktiv och snabb metod för att mäta glomerulär permeabilitet hos möss med hjälp av fluorescerande märkt FITC-polysackaros 70. Genom att införa en transuretral kateter, urin insamling är mindre invasiv än urinblåsan punktering, urethrotomy, och suprapubisk kateter ansökan, och tillåter urin insamling minst var 30 min. urinanalys utförs från små mängder (5 μl) med hjälp av en fluorescerande Plattläsare. Spårningskoncentrationer i urinen normaliseras till kreatininkoncentrationer i urinen med hjälp av en enzymatisk kreatininhalt.
Därför, denna nya metod erbjuder ett känsligt verktyg för att studera tidig glomerulär skada med ökad glomerulär permeabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterade metoden gör det möjligt för prövaren att testa glomerulär permeabilitet hos möss på ett mycket känsligt sätt med hjälp av en Tracer. Med denna metod, kortsiktiga ökningar i glomerulär permeabilitet kan diagnostiseras med endast små mängder av urin. De mest kritiska stegen för att framgångsrikt bemästra denna teknik är 1) utveckla manuell expertis i mus kirurgi, särskilt i kanyleringen av en central ven, 2) Placera urin katetern utan att skada slemhinnan, och 3) manuell expertis vid han…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Christina Schwandt, blanka Duvnjak och Nicola Kuhr för deras exceptionella tekniska stöd och Dr Dennis Sohn för hans hjälp med fluorescens Scan. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 till L.C.R. och L.S. Finansiär hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
