Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til påvisning og kvantificering af protein niveauer under craniofacial morfogenesis/patogenesen ved immun farvning ved hjælp af mus craniofacial væv som eksempler. Derudover beskriver vi en metode til klargøring og kryoskæring af undecalcificeret hårdt væv fra unge mus til immun farvning.
Abstract
Vævs immun farvning giver meget specifik og pålidelig påvisning af proteiner af interesse inden for et givet væv. Her beskriver vi en komplet og enkel protokol til påvisning af protein ekspression under craniofacial morfogenesis/patogenese ved hjælp af mus kraniofacial væv som eksempler. Protokollen består af forberedelse og kryoskæring af væv, indirekte immunofluorescens, billed erhvervelse og kvantificering. Desuden beskrives en metode til klargøring og kryoskæring af undecalcificeret hårdt væv til immun farvning, ved hjælp af craniofacial væv og lange knogler som eksempler. Disse metoder er nøglen til at bestemme protein ekspression og morfologiske/anatomiske ændringer i forskellige væv under kraniofacial morfogenesis/patogenese. De gælder også for andre væv med passende ændringer. Viden om histologi og høj kvalitet af sektioner er afgørende for at drage videnskabelige konklusioner fra eksperimentelle resultater. De potentielle begrænsninger ved denne metode omfatter, men er ikke begrænset til, specificitet af antistoffer og kvantificerings vanskeligheder, som også drøftes her.
Introduction
Ansigtet er en vigtig del af menneskets identitet, og er sammensat af flere forskellige typer af væv, såsom epithelium, muskel, knogle, brusk, tand. Disse væv er afledt af alle tre kimlag: ectoderm, endoderm, og mesoderm1,2. For korrekt mønster og udvikling af craniofacial væv, celle spredning, død og differentiering skal være stærkt koordineret og reguleret af specifikke signalerings veje, såsom WNT, FGF, HH og BMP veje3,4 ,5. Defekter i spredning, overlevelse eller differentiering af celler vil føre til craniofacial misdannelser, som er blandt de hyppigst forekommende medfødte fødselsdefekter. Transgene mus er nyttige værktøjer til at studere mekanismer af craniofacial morfogenesis og patogenese1,2,3,4,5. Forståelse af ændringer i kraniofaciale strukturer under udvikling og patogenese vil bidrage til at afklare vigtige udviklingsmæssige principper samt mekanismerne i craniofacial misdannelser1,2,3 ,4,5.
Farvning af hele mount eller sektioneret væv med specifikke antistoffer er en uvurderlig teknik til bestemmelse af rumlig fordeling af proteiner af interesse 6. Formelt kan vævs immun farvning stole på enten immun histokemi (IHC) eller immunofluorescens (hvis). Sammenlignet med det uigennemsigtige reaktionsprodukt genereret med et kromogent substrat som 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) af IHC, hvis det involverer brug af fluorescerende konjugater, der er synlige ved Fluorescens mikroskopi. Derfor, hvis kan tydeligt skelne positive celler fra baggrundsstøj, og tillader billeder, der skal analyseres kvantitativt og forbedret i en ligetil måde ved software som ImageJ og Adobe Photoshop7,8. Hele Mount farvnings metoden virker på små blokke af væv (mindre end 5 mm tyk), som kan give tredimensionelle oplysninger om placeringen af proteiner/antigener uden behov for genopbygning fra afsnit9,10 . Men sammenlignet med vævs sektioner er hele Mount immunofarvning tidskrævende og kræver store mængder af antistof opløsninger. Ikke alle antistoffer er kompatible med den grundlæggende hele monteringsmetode. Desuden vil den ufuldstændige indtrængen af antistoffer resultere i ujævn farvning eller falsk negativ farvning. Her vil vi fokusere på immunofluorescens påvisning af proteiner/antigener på sektionerede væv. For hårde væv (f. eks, hoved, tand, lang knogle), calcium deposition under udvikling/patogenesen gør prøven vanskeligt at afsnittet og let skylles ud under immun farvning behandling11,12. De fleste af de i øjeblikket tilgængelige protokoller Afkalk hårde væv før indlejring for at gøre skæring lettere, hvilket er tidskrævende og kan ødelægge morfologi og antigener af prøver, hvis håndteres forkert11,12. For at overvinde problemerne optimerede vi en tilgang til kryosectioning af hårde væv uden afkalkning, hvilket førte til forbedret visualisering af deres morfologi og distribution af signalerings proteiner.
Den her beskrevne protokol anvendes til at bestemme morphometriske og histologiske ændringer i det craniofaciale væv i BMP-Transgene mus. Specifikt, protokollen indeholder (1) høst og dissekere hoved væv, (2) sektion og immunofarvning af eksperimentelle markører (Ki67, pSmad1/5/9) sammen med Tunel farvning, (3) Imaging afsnittene ved hjælp fluorescens mikroskop, og endelig (4) analyse og kvantificering af resultaterne. Protokollen til forberedelse og kryosektions hårde væv uden afkalkning er også beskrevet13. Disse metoder er optimeret til craniofacial væv. De gælder også for andre væv fra forskellige aldre af prøver med passende ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus eksperimenter blev udført i overensstemmelse med University of Michigan retningslinjer, der dækker Human pleje og anvendelse af dyr i forskning. Alle de dyreforsøg, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev godkendt af Udvalget for institutionel dyreomsorg og-anvendelse (IACUC) ved University of Michigan (protokol #PRO00007715).
1. vævs tilberedning
-
Klargøring af embryonale væv
- Forbered 1 10 cm skål og flere 3,5 cm retter indeholdende fosfat bufferet saltvand (PBS), og 1 12-brønd kultur plade indeholdende 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i hver brønd for hver gravid mus. Placer alle Petri skåle og pladen på is.
Bemærk: Håndtag 4% PFA i en røg hætte. - Dissekere embryoner fra drægtige mus i iskold PBS med pincet og saks som tidligere beskrevet14.
- Kortvarigt, aflive en gravid mus med co2, grab huden under midten af maven med pincet og skæres gennem huden kun, derefter forsigtigt trække på huden for at adskille det fra den underliggende mave muskulatur væggen.
- Dernæst skæres i bughulen efter den samme linje af huden incision. Fjern livmoderen, der indeholder en streng af embryoner og fjerne embryonerne ved forsigtigt at skære væk livmodervæggen. Det ekstrudare væv såsom blommesækken og amnion vil blive fjernet.
- Skær og Isoler hovedet fra hvert embryo.
- Overfør hvert hoved til hver brønd af en 12-brønd plade, der indeholder 4% PFA med en plastik overførings pipette eller pincet. Fix prøverne i 4% PFA ved 4 °C i 4 timer. Skyl prøverne i PBS ved 4 °C med blid omrystning i 12 timer.
Bemærk: For embryoner, som er yngre end embryonale dag 16,5 (E 16,5), fastsættes embryonerne med 4% PFA direkte efter isolationen. For embryoner på E 16.5 eller senere, Fjern for at kassere hud og fedtvæv fra hovederne og skyl flere gange i iskold PBS før fiksering. - Kryoprotect hoveder.
- Hver hoved overføres til en ny 12-brønd plade, der indeholder 2 mL 30% saccharose i PBS med en plastik overførings pipette eller tang. Omrystes forsigtigt ved 4 °C, indtil hovedet synker ned til bunden af skålen.
- Integrer hoveder.
- Overfør det kryoproterede hoved til en skimmel, der indeholder optimal skære temperatur (OCT) sammensatte. Prøver i oktober i flere minutter. Justér placeringen og retningen af prøverne med pincet.
- Anbring formen på tøris for at fryse. Opbevar resulterende cryomolds i en plastikpose ved-80 °C, indtil den er klar til kryosecering.
Bemærk: Den trimmede side af prøverne skal stå over for bunden af indlejrings formen.
- Forbered 1 10 cm skål og flere 3,5 cm retter indeholdende fosfat bufferet saltvand (PBS), og 1 12-brønd kultur plade indeholdende 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i hver brønd for hver gravid mus. Placer alle Petri skåle og pladen på is.
-
Forberedelse af postnatale undecalcificeret hårdt væv
- Euthanize på 3 uge eller 3 måneder gammel mus med CO2. Fjern huden og fedtvæv. Skær og Isoler hovedet eller lange knogler fra musen.
- Fix og cryoprotect hovedet eller lange ben af mus som beskrevet i trin 1.1.3 – 1.1.4.
- Integrer i 8% gelatine på en lignende måde som trin 1.1.5. Opbevar cryomolds i en plastikpose ved-80 °C indtil kryosectioning.
Bemærk: Afkalkning er ikke nødvendig her. For at tilberede 8% gelatine, bland 8 g gelatine med 100 mL PBS og kog ved hjælp af en mikrobølgeovn. Vær opmærksom på, at blandingen koger over let.
2. cryosectioning
- Indstil kryostat temperatur til-18 °C for blødt væv indlejret i OLT eller-25 °C og lavere for undecalcified hårde væv indlejret i gelatine. Opbevar prøverne i kryostat-kammeret i ca. 30 min for at ækvibrere til kryostattemperaturen.
- Udsæt blokken fra cryomold. Frys blokken på prøve patronen (vævs holderen) via montering med et OLT-fald. Hold den trimmede side af prøven længst væk fra borepatronen (mod operatøren).
- Læg den blok monterede borepatron på kryostat-objekt holderen. Juster klingeholderen, så vinklen på klingen er 3 ° – 5 ° i forhold til prøven.
- Saml 10 μm sektioner på coatede mikroskop slides. Tør sektioner helt ved RT, og opbevar dem derefter ved-80 °C.
3. histologisk farvning og mikroskopisk billeddannelse
- Immunofluorescens farvning
- Tag slides fra-80 °C. Hold slides på RT for 1 time til airdry sektioner. Skyl gliderne i 0,1% PBST (0,1% polyethylenglycol tert-octylphenyl ether i PBS; Se tabel over materialer) tre gange for 5 min hver for at vaske ud OLT og permeabilize sektioner.
- Alternativt, Udfør antigen hentning (valgfrit).
- Forvarme citratbuffer (10 mM natriumcitrat pH 6) i farvnings skålen med dampdamper eller vandbad til 95 – 100 °C. Nedsænk slides i citratbuffer, Inkuber i 10 min.
- Tag farvnings skålen ud fra dampdamper eller vandbad til RT. Afkøl diasene ved RT i 20 minutter eller længere15.
Bemærk: Som alternativer anvendes Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-base, 1mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) eller EDTA-buffer (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) til genfinding af varme induceret antigen. Brug en trykkoger, mikroovn eller vandbad til varme induceret antigen hentning, ud over den varme damper. En enzym induceret antigen-hentning ved hjælp af trypsin eller pepsin er et andet alternativ. Optimer koncentrationen og behandlingstid af enzymatisk hentning for at undgå skadelige sektioner. Metoder til at optimere antigen genfinding for hver kombination af antistoffer/antigen.
- Inkuber hvert lysbillede med 200 μL blokerende opløsning (5% æsel serum fortyndet i 0,1% PBST) ved RT i 30 minutter, og fjern derefter blokerings opløsningen uden skylning.
- Hvert lysbillede inkubates med 100 μL primært antistof eller antistoffer fortyndet i blokerende opløsning i 1 time ved RT eller O/N ved 4 °C. Skyl slides med PBS tre gange i 10 min hver på RT.
- Hvert lysbillede inkubates med 100 μL sekundært antistof fortyndet i blokerende opløsning i 1 time ved RT. Skyl lysbilleder i PBS tre gange i 10 minutter hver på RT. Beskyt lysbilleder mod lys.
- Monter slides.
- Tilsæt to dråber anti-fade medium med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) på diaset. Dæk derefter med en dækseddel.
- Opbevares ved 4 °C i mørke indtil klar til billede.
Bemærk: Alternativt kan du mærke kerner med dapi eller Hoechst 33324 Dye fortyndet 1:2000 i PBS ved rt først og derefter montere med glycerol.
- Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick ende mærkning (TUNEL) farvning.
Bemærk: Dobbeltstrenget DNA med 3 '-hydroxyl Termini (3 ' OH DNA Termini) vil danne under apoptose i cellen. Her giver vi en protokol, der mærker den frie 3 ' OH DNA Termini in situ via mærkning DNA fragmenter med digoxigenin-nucleotid ved hjælp af Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) ved specifik farvning ved brug af en kommerciel Kit (Se tabel over materialer ).- Eventuelt pletter sektioner med primære og Alexa fluor-488 mærket sekundære antistoffer før TUNEL farvning. Skyl gliderne i PBS tre gange i 10 minutter hver.
Bemærk: Dette trin er valgfrit for en dobbelt farvning af et protein og TUNEL i samme slide. - Hvert lysbillede inkubates med 100 μL proteinase K (10 μg/mL i 10 mM Tris pH 7,5 og 5 mM EDTA) i 5 minutter ved RT. Skyl slides med PBS tre gange i 10 minutter hver på RT.
Bemærk: Juster inkubationstiden og temperaturen af proteinase K for hver vævstype. For 10 μm sektioner af embryon hoveder fastgjort i 4% PFA, inkubere i 5 min ved RT. Ud over metoden ved hjælp af proteinase K, brug alternative behandlinger efter behov, herunder (1) frisklavet 0,1% polyethylenglycol tert-octylphenyl ether, 0,1% natriumcitrat, 10 min ved 37 °C; (2) 0,25% – 0,5% pepsin i HCl (pH 2) eller 0,25% trypsin, 10 min ved 37 °C; og (3) mikrobølge bestråling med 0,1 M citratbuffer (pH 6). - Påfør 200 μL blokerende opløsning (5% æsel serum fortyndet i 0,1% PBST) til hvert lysbillede, Inkuber ved RT i 30 minutter, Tap på blokerings opløsningen uden skylning.
- Påfør 50 μL af den ækvibrationsbuffer, der leveres af sættet, til hvert dias ved RT i mindst 10 s. Tryk på bufferen uden skylning.
- Forbered reaktionsblandingen (arbejdsstyrke TdT enzym) ved at blande TdT enzym med den reaktionsbuffer, der leveres af kittet, med forholdet 3:7. Påfør 50 μL af reaktionsblandingen på hvert lysbillede, og Inkuber ved 37 °C i 1 time. Tryk på bufferen uden skylning.
- Påfør 200 μL af stop bufferen (1:30 fortyndet i ddH2O) leveret af sættet til hvert lysbillede, og Inkuber derefter ved rt i 10 min. Skyl lysbilleder med PBS tre gange i hver 10 min.
- Etiket med Rhodaminanti stof.
- Påfør 50 μL pre-warmed (RT) anti-digoxigenin konjugat (rhodamin) (1:1 fortyndet i blokerende opløsning) til hvert dias. Inkuber ved RT i 30 minutter i mørke.
- Skyl slides med PBS tre gange i 10 minutter hver. Monter slides som trin 3.1.6.
- Eventuelt pletter sektioner med primære og Alexa fluor-488 mærket sekundære antistoffer før TUNEL farvning. Skyl gliderne i PBS tre gange i 10 minutter hver.
4. erhvervelse af billeder
- Brug positive kontroller (væv, som er positive for målantigen) til at kontrollere signal mærkning og negative kontroller (udelad det primære antistof, isotype kontrol eller væv, som er negativt for målantigen) for at evaluere baggrunden for billeder under det fluorescerende Mikroskop.
- Indstil udstyr og kamera forhold (eksponeringer og andre generelle indstillinger) til billeddannelse baseret på signal intensiteten af negative og positive kontroller.
Bemærk: Disse betingelser varierer efter (1) kameraer og mikroskoper, der anvendes til billeddannelse, (2) antistoffer, og (3) væv for hvert eksperiment. Almindelige betingelser for craniofacial væv er ISO 200 med en eksponeringstid, der spænder fra 1/100 s til 1 s afhænger af kvaliteten og specificiteten af antistoffer. Passende forstørrelser varierer afhængigt af prøvernes størrelse og formålet med forsøgene. - Erhverve billeder med konventionelle epifluorescens mikroskop eller confokale mikroskop. Hent billeder (herunder tilsvarende kontrolelementer) under de samme betingelser for hver farvekanal. Gem billeder med samme format (TIFF er bedst til at bevare oplysninger).
5. kvantificering af fluorescens
Bemærk: En statistisk sammenligning af farvningen mellem forskellige grupper vil i mange tilfælde være mere informativ. Med immunofluorescens billeder kvantificeres det relative niveau af proteinet ved at måle signal tætheden, tælle positive celler eller beregne positive områder. Til statistisk analyse er minimumsantallet af biologisk uafhængige prøver 3. En typisk metode er at generere mindst tre sektioner fra hver prøve og tage billeder for mindst tre repræsentative områder i hvert afsnit.
-
Kvantificering af fluorescens intensitet ved hjælp af ImageJ
- Åbn softwaren, og brug Analysér ≫ indstillede målinger til at kontrollere, at kun område og integreret tæthed er valgt. Brug fil > åbne for at åbne billeder, der skal analyseres.
- Brug Toolbar til at vælge enten ikonet firkantet eller cirkel længst til venstre. Vælg det område, der skal analyseres på billedet, ved hjælp af markeringsværktøjet. Brug Analysér > måle for at få udlæget af det valgte område og den integrerede tæthed i resultatvinduet. Vælg et område ud for en positiv celle, der ikke har fluorescens, for at læse baggrunden.
- Gentag trin 5.1.2 for at analysere andre billeder. Justeret det område, der skal analyseres, så det svarer til det første billede.
- Kopiér alle data i resultatvinduet, og Indsæt dem i et regneark, når du er færdig med at analysere.
- Den korrigerede fluorescens intensitet (CTCF) beregnes som en integreret densitet — (område med valgt celle x gennemsnitlig fluorescens af baggrunds aflæsninger). Sammenlign forskellen i den korrigerede totale celle fluorescens mellem prøverne og lav en graf.
-
Kvantificering af det positive celleantal af fluorescerende billeder ved hjælp af ImageJ
- Manuel celletælling.
- Brug ImageJ > plugins > analyse til at installere Cell Counter plugin.
- Brug fil > åbne for at åbne billeder, der skal analyseres. Brug Plugins > analyse > celle tæller for at åbne tællervinduet og resultatvinduet.
Bemærk: Celle tælleren virker ikke på stakke. For optælling stakke, plugin plot z Axis profil, derefter bruge billede ≫ stakke > plot z Axis profil til at overvåge intensiteten af en bevægende ROI ved hjælp af en partikel tracking værktøj. Dette værktøj kan enten være manuel eller automatisk. - Klikke på en af knapperne nederst i vinduet tæller for at starte optællingen. Klik direkte på en celle/et objekt, der skal tælles, indtil du afslutter.
- Klik på knappen resultater i vinduet Tæl . Det samlede antal optalte celler vises i resultat vinduet. Gem resultat loggen som regneark, og analysér.
- Automatiseret celletælling.
- Brug fil > åbne for at åbne billeder, der skal analyseres. Konverter RGB-billedet til et gråskala-billede, før du fortsætter.
- Brug billed > Juster > tærskel for at vælge alle de områder, der skal tælles.
- Brug analysér ≫ analysere partikler for at få antallet af celler/partikler. Angiv en række af den gyldige partikelstørrelse (f. eks. 100-Infinity) i stedet for standarden på 0-uendeligt for at tælle celler/partikler inden for et bestemt interval. Gem resultat loggen som regneark, og analysér.
Bemærk: for at få andre oplysninger fra billedet, foruden område, skal du gå til Analysér > indstillede mål , og Markér feltet ud for de nødvendige oplysninger.
- Manuel celletælling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embryonale craniofaciale vævs sektioner
Efter ovenstående trin blev hoveder dissekeret fra kontrol (p0-CRE) eller mutant (konstitutivt aktiveret Bmpr1a i neurale crest celler, p0-CRE; caBmpr1a) embryoner på embryon dag (E) 16,5 eller 18,5. Efter fastsættelse i 4% PFA for 4 h, prøver blev indlejret i OLT og cryoseceret coronally. Resulterede sektioner var immun farvede med antistoffer mod pSmad1/5/9 (downstream BMP signalering faktorer) eller Ki67 (en celle spredning markør) uden antigen hentning i henhold til protokollen. Som vist, pSmad1/5/9 (figur 1a) og Ki67 (figur 1c) var positive i de frontale knogler af kontrol embryoner. I muterede embryoner blev niveauerne af pSmad1/5/9 forhøjet (figur 1b), mens de af Ki67 blev nedsat (figur 1d) i de frontale knogler. Celledød i disse prøver blev også kontrolleret i henhold til protokollen. Som vist blev der observeret flere apoptotiske celler i de forreste knogler af mutante embryoner end i kontrol embryoner (figur 1E, F).
Undecalcificeret craniofacial væv eller lange knogle sektioner
Efter ovenstående trin for undecalcified hårde væv, hoveder fra 3 uger gamle mus (p0-CRE; mTmG (membran-tomat og membran gfp)) blev fastsat med 4% PFA og indlejret i 8% gelatine. Coronal cryosektioner blev vasket med PBST og monteret med anti-fade medium med DAPI. Figur 2a , B påvise, at gelatine ikke interfererer med fluorescerende signaler fra sektioneret væv.
Hoveder og femora fra 3 uger gamle eller 3 måneder gamle mus blev ansat til at kontrollere, om gelatine indlejret undecalcified væv er godt for hvis. Hele hoveder og femora blev behandlet og opdelt i henhold til protokollen. De resulterede sektioner blev brugt til SOX9 immunofarvning (figur 3) eller OSX og E11/Podoplanin dobbelt immun farvning (figur 4). Som vist blev der opnået gode kvalitets sektioner fra de fleste af de 3 ugers hårde væv, herunder trabekulær og de kortikale rum i femur (figur 3a, B, figur 4a– D), de frontale knogler (figur 4e, F), den fortand (figur 3e, F, figur 4i, J), nasal væv (figur 3c, D), og kraniet, herunder nasal-premaxilla sutur og omgivende knogler (figur 4g, H ) af hovedet. Mens der med 3-måneders-gamle prøver kun blev opnået gode kvalitets sektioner i nogle af de hårde væv, herunder de trabeculære rum i femur (figur 3g, H, figur 4k, L), nasal væv (figur 3i , J), og kraniet, herunder næse-premaxilla sutur og omgivende knogler (figur 4m, N) af hovedet. Som vist i figur 3blev der påvist SOX9 positive celler specifikt i chondrocytter af vækstpladen (figur 3b) og leddet (figur 3h) fra femur og næse septum (figur 3D, J). I den 3 uger gamle incisor blev der påvist SOX9 i mesenchymalcellerne (figur 3F). OSX og E11 dobbelte farvnings resultater viste, at OSX blev påvist i osteoblaster, mens E11 blev påvist i osteocytter af knogler fra femur og hoved (figur 4b, D, H, L, N). I den 3 ugers incisor var OSX positiv i odontoblaster, mens E11 var positivt i follikel mesenchymal celler (figur 4J). Disse resultater indikerer, at undecalcified hårde væv indlejret med gelatine godt-bevare antigen funktioner.
Figur 1: eksempler på, om resultaterne af pSmad1/5/9, Ki67 eller TUNEL i kontrol embryoner og mutante embryoner med forbedret BMP-aktivitet. Konstitutivt aktiverede Bmpr1a (caBmpr1a) mus blev krydset med p0-CRE mus for at øge BMP signalering aktivitet i neurale crest celler (NCCS). Lederne af kontrol (p0-CRE; caBmpr1a+/+) og mutant (p0-CRE; caBmpr1afx/+) embryoer blev opløst ved e 16,5 eller e 18.5, fikseret med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% saccharose i 1 dag, indlejret i OLT, og cryoseceret ved-18 °C. Dele af den frontale knogle (lignende niveau med øjet) blev anvendt til immunodetektion mod pSmad1/5/9, Ki67, eller TUNEL farvning. (A, B) pSmad1/5/9 (grøn) farvning mønstre i de forreste knogler af kontrol (a) eller mutant (b) embryoner på e 16.5. (C, D) Ki67 (grøn) farvning mønstre i de forreste knogler af kontrol (C) eller mutant (D) embryoner på e 18.5. (E, F) TUNEL (rød) farvning mønstre i de forreste knogler af kontrol (e) eller mutant (F) embryoner på E 18.5. Kerner blev plettet med DAPI (blå). FB = frontal knogle, B = hjernen. Skala stænger = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempler på mTmG reporter signalerer resultater af undecalcificeret væv i hovedet. Hoveder fra 3 uger gamle p0-CRE mus med membran-tomat og membran gfp (mtmg) reporter blev dissekeret, fastgjort med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% saccharose i 2 dage, indlejret i 8% gelatine, og cryosekeret ved-25 °c. Hovedsektioner viser tydeligt GFP (grøn, CRE rekombination positiv) og tomat (rød, CRE rekombination negativ) signal i næse knoglen og nasal væv (A, B). Kerner blev plettet med DAPI (blå). NB = nasal knogle, N = nasal væv, NS = nasal septum. Skala stænger = 250 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempler på SOX9 immunofarvning resultater af undecalcified væv i hovedet og femora. Hoveder og femora blev dissekeret fra 3 uger eller 3 måneder gamle mus, fastgjort med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% saccharose i 2 dage, indlejret i 8% gelatine, og cryosekeret ved-25 °C. Slides blev brugt til immunodetektion mod SOX9 (rød). Kerner blev plettet med DAPI (blå) (B, D, F, H, J). Tilstødende dele af disse væv blev anvendt til Hematoxylin & eosin (H & E) farvning (A, C, E, G, I). Pilehoveder i A og B angiver vækstpladen og i G og H, artikulær brusk. Pilene i A og G indikerer trabekulær knogler og i C, D, i og J, nasal septum. DM = dental mesenchyme, DE = dental Epitelet, FM = follikel mesenchyme. Skala stænger = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksempler på OSX og E11 dobbelt immun farvning resultater af undecalcified væv i hovedet og femora. Hoveder og femora blev dissekeret fra 3 uger gamle eller 3 måneder gamle mus, fastgjort med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% saccharose i 2 dage, indlejret i 8% gelatine, og cryosekeret ved-25 °C. Sektioner blev anvendt til dobbelt immun farvning med antistoffer mod OSX (rød) og E11/Podoplanin (grøn). Kerner blev plettet med DAPI (blå) (B, D, F, H, J, L, N). Tilstødende dele af disse væv blev anvendt til H & E farvning (A, C, E, G, I, K, M). Pilene i A, B, K og L indikerer trabeculære rum i femur; C og D, de kortikale rum i femur; og i E og F, de frontale knogler. Arrowheads i A og B indikerer vækstpladen. BM = knoglemarv, N = nasal væv, DM = dental mesenchyme, de = dental Epitelet, FM = follikel mesenchyme, NPS = nasal hver sutur. De frontale knogler (E, F) og nasal-premaxilla sutur og omgivende knogler (G, H, M, N) vises også. Skala stænger = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi en detaljeret protokol til fremstilling af muse hoved og undecalcified knogle væv, og kryosectioning for immun farvning af celle spredning, celledød, og BMP signalering markører. Vi har også detaljeret strategi for opnåelse af kvantitative data fra immunfluorescent billeder. Disse metoder kan også anvendes på andre væv med passende ændringer.
Betingelser for vævs præparation varierer afhængigt af vævets størrelse og type. Fiksering og kryoprotection tid normalt brug for flere timer til natten. Efter fiksering kan vævet også indlejres i paraffin og sektioneret med en mikrotom16. Selvom både paraffin og OCT fungerer godt for immun farvning, der er nogle forskelle mellem dem. Paraffin blokke kan opbevares i flere år på RT, mens OCT blokke er for 1 år ved-80 °C. Paraffin bevarer vævs morfologi, mens iskrystal dannet under OLT indlejring kan påvirke vævs strukturerne negativt. Paraffin undertiden masker epitoper af antigener, mens OLT bevarer enzym aktiviteter og antigen epitoper. Derfor er der ikke behov for antigen hentning for de fleste af de antistoffer, hvis fastsat i 4% PFA for kun 4 h eller mindre og indlejret i oktober. Det er dog stadig muligt at opnå bedre resultater ved at hente antigen, hvis positive kontroller ikke viste gode farvnings resultater i kryosektioner.
Både Hoechst Dye og DAPI kan anvendes til nuklear kontra farvning. De har ligheder, da begge (1) er UV-spændte, mindre Groove-binding kemikalier til at udsende signaler proportional med total DNA-indhold, og (2) er udsat for foto-blegning efter en lang eksponering. Men Hoechsts farvestoffer anvendes typisk til farvning af DNA-indhold i levende celler på grund af deres høje permeabilitet. DAPI bruges typisk til farvning af DNA i faste celler på grund af dens lave membran permeabilitet. Desuden genererer DAPI et stærkere og mere stabilt signal end Hoechst.
Korrekt kontrol er afgørende for, hvis. Specificiteten af hvert nyt antistof bør bekræftes af Western blot-analyse, hvis det er relevant. Den optimale arbejds koncentration af et bestemt primært antistof bør bestemmes ved anvendelse af serielle fortyndinger. En positiv kontrol (væv eller celle, der er bevist at udtrykke protein/antigen) bør medtages for at kontrollere, om processen og specificitet af antistof. Der bør også medtages en negativ kontrol, fx fravær af det primære antistof, eller substitution af normal IgG fra samme art for det primære antistof eller væv, der er negativt for målantigen. Når du tager billeder, bør prøven uden sekundære antistoffer (baggrundskontrol) undersøges uafhængigt med hver kanal for at indstille grænserne for signal forstærkning og offset, der skal tilpasses til den endelige billeddannelse. Til påvisning af flere etiketter skal baggrundskontrol og enkelt mærkede Kontroller være forberedt for at undgå spektral overlap artefakter. Alle kanaler, der vil blive brugt til at få et billede af en multi-label prøve skal underkastes uafhængig baggrundskorrektion, fordi graden af autofluorescens i hver kanal varierer betydeligt.
Vi leverer også protokollen til forberedelse og kryosectioning af undecalcified hårde væv indlejret i gelatine. For OLT indlejret afkaldede hårde væv, de fleste af de hårde væv sektioner vil blive løsrevet fra slide briller under immunofarvning procedurer, på grund af deres lave vedhæftning karakter på diaset. Den klæbende tape designet til at lette kryosectioning hjælper med at generere god kvalitet sektioner. Men disse sektioner er let beskadiget, når båndet skrælle. For gelatine indlejret væv, er der ikke behov for en tape-Transfer system til at generere god kvalitet sektioner. Som en indlejring medium, gelatine kan infiltrere prøven godt, selv om det har en lavere viskositet sammenlignet med Oct. gelatine har været anvendt i andre histologiske anvendelser, såsom hjernevæv17,18 og ultratynde dele af celler for immunocytokemi19. Her, gelatine blev brugt til at indlejre undecalcificeret knogle, som genererer blokke lettere at kryosektion end okt. Der er flere små tips til at få gode sektioner af gelatine indlejret undecalcified hårde væv. Det kritiske skridt er at indlejre med gelatine i stedet for OLT. For at få bedre penetration, holde prøver i 30% saccharose en dag mere efter prøverne synke til bunden. Det er lige så vigtigt at indstille temperaturen lavere end normalt ved omkring-25 °C. En Ultra-skarp klinge er ikke nødvendig. Selv om en lavere Cryo temperatur (-25 °C) gør nogle forbedringer for kryosectioning af OCT indlejret undecalcified hårde væv, er det stadig vanskeligt at få en god integritet af vævsstrukturer. Som vist i figur 2, figur 3, og figur 4, blev der opnået gode kvalitets sektioner for immun farvning fra gelatine indlejret hårdt væv (f. eks. trabekulær knogler, kortikale knogler, kranieben, nasal væv og incisor). Disse resultater viste, at gelatine indlejring betydeligt forbedrer prøve integriteten af hårde vævs sektioner, men også forbedrer vedhæftningen af sektionerne til slide briller. Desuden, gelatine bevarer antigen funktioner, og udviser kompatibilitet med fluorescerende signaler og immun farvning. Men denne teknik fungerer kun godt for op til 3 måneder gamle prøver. Potentielle forbedringer af denne metode er (1) at dissekere prøverne yderligere at adskille målvævet fra andre dele for at gøre strukturen af vævet enkelt (i tilfælde af tænder, skal mandiblen eller kæben dissekeret og fast i stedet for hele hovedet) og (2) at bruge 10% EDTA til at Afkalk væv for kun 2 – 3 dage før kryoprotection. Denne korte tid af afkalkning vil ikke kompromittere immun farvning resultater. Et andet problem er, at gelatine som et ikke-vandigt indlejrings medie ikke let kan fjernes fra lysbilleder, hvilket kan føre til en højere baggrund afhængigt af farvnings metoderne (f. eks. H & E farvning).
Immun farvning resultater er ikke let at kvantificere, så de er normalt anvendes semi-kvantitativt. Vanskeligheder og begrænsninger i kvantificeringen af immun farvning af kraniofacial væv omfatter, men er ikke begrænset til følgende: (1) det er vanskeligt at definere det areal, der skal tælles på grund af kompleksiteten af strukturen af craniofacial væv; (2) det er vanskeligt at definere det mærkede område eller mærkede celler på grund af den ikke-lineære karakter af immun farvning; (3) der er begrænset information om signalets dynamikområde; (4) det er svært at sammenligne intensiteten af signaler mellem billeder eller grupper på grund af fading af fluorescerende signal under billed erhvervelse; og (5) signalet baggrund kan ændre sig betydeligt blandt antistoffer, dias, og prøver. For at øge pålideligheden af kvantificerings resultaterne skal eksperimentet omhyggeligt og strengt udføres. Alle prøver skal forarbejdes under de samme betingelser. Under immun farvning kræves der forskellige kontroller for at evaluere signal baggrunden og definere det positive område eller cellerne for signalet. Tag overbevisende og repræsentative billeder til klart at vise det område, der skal tælles og mærket celler med god kontrast. Under billed anskaffelsen skal kameraets indstilling og udstyrs indstilling desuden holdes konsistent.
Tilsammen præsenterer vi en simpel standardprotokol for immunofluorescens på mus craniofacial væv, især for undecalcified hårde væv. Immunofarvning analyse af kraniofacial væv vil ikke kun bidrage til at forstå mekanismen af morfogenesis under udvikling, men også illustrere ændringerne under patogenesen. Desuden kan immun farvning også bruges til at studere udtryks mønstret for andre signalveje-ligands, receptorer eller andre fænotypiske markører, foruden celle spredning, celledød og BMP-signalering-vejen. De kritiske trin i et immunofarvnings eksperiment skal dog modificeres korrekt for hvert antigen/antistof eller væv for at opnå specifik farvning og minimerede ikke-specifikke baggrunds signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01DE020843 til Y.M.), den internationale FOP Association (Y.M.), og en tilskud-i-støtte fra National Natural Science Foundation i Kina (31500788 til J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C.
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
