Coloration des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans le tissu adipeux
Summary
La formation de vaisseaux sanguins et une innervation sympathique jouent un rôle essentiel dans le remodelage du tissu adipeux. Cependant, il reste des aspects techniques de visualisation et de mesurer quantitativement le tissu adipeux. Nous présentons ici un protocole pour étiqueter correctement comparer quantitativement les densités des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans différents tissus adipeux.
Abstract
Des études récentes ont mis en évidence le rôle crucial de l’angiogenèse et l’innervation sympathique dans le tissu adipeux se transformant au cours du développement de l’obésité. Donc, il est nécessaire d’élaborer une méthode simple et efficace afin de documenter les changements dynamiques dans le tissu adipeux. Nous décrivons ici une approche modifiée par immunofluorescence qui efficacement les taches conjointement les vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans les tissus adipeux. Par rapport aux méthodes traditionnelles et récemment développés, notre approche est relativement facile à suivre et plus efficaces dans les vaisseaux sanguins et fibres nerveuses avec des densités plus élevées et moins de fond de l’étiquetage. En outre, la plus haute résolution des images plus permet de mesurer avec précision la zone des vaisseaux, montant de ramification et la longueur des fibres de logiciels open source. Comme une démonstration à l’aide de notre méthode, nous montrons que le tissu adipeux brun (TAB) contient des quantités plus élevées de vaisseaux sanguins et fibres nerveuses comparés au tissu adipeux blanc (WAT). Nous avons en outre trouver que parmi les WATs, WAT sous-cutanée (sWAT) a plus de vaisseaux sanguins et fibres nerveuses par rapport au WAT épididymaire (eWAT). Notre méthode fournit donc un outil utile pour étudier le remodelage du tissu adipeux.
Introduction
Le tissu adipeux a clé métabolique et endocriniens fonctions1. Il dynamiquement se dilate ou se contracte en réponse aux différents nutriments souligne2. Le tissu actif, transformant le processus se compose de multiples chemins/étapes physiologiques dont l’angiogenèse, fibrose et façonnage des micro-environnements inflammatoire local2,3,4. Certains stimuli physiques, comme l’exposition au froid et l’exercice, peuvent déclencher l’activation sympathique, qui conduit finalement à la formation de vaisseaux sanguins et une innervation sympathique dans le tissus adipeux5,6. Ces processus de remodelage sont liées étroitement aux résultats métaboliques systémiques, y compris la sensibilité à l’insuline, le signe distinctif du type 2 diabète2. Ainsi, la visualisation de ces changements pathologiques est très importante pour comprendre la bonne situation de l’ensemble des tissus adipeux.
L’angiogenèse est le processus de la formation de vaisseaux sanguins. Puisque les vaisseaux sanguins fournissent l’oxygène, des nutriments, hormones et facteurs de croissance des tissus, l’angiogenèse a été considérée comme une étape clé dans le remodelage de tissu adipeux, qui a été documentée avec différentes techniques6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Cependant, il reste des questions sur la résolution des images, l’efficacité d’immunomarquage et de méthodes pour la quantification de la masse volumique de navire. Par rapport à la formation de vaisseaux sanguins, innervation dans le tissu adipeux a été sous-estimé pendant une longue période. Récemment, Zeng et al. 14 utilisé la microscopie intravitale deux photons de pointe et a démontré que les adipocytes sont entourés de couches de fibres nerveuses14. Depuis lors, les chercheurs ont commencé à apprécier le rôle pivot de l’innervation sympathique dans le règlement de la physiologie du tissu adipeux. Ainsi, il est important d’élaborer une approche simple et pratique d’innervation du nerf adipeuse document.
Nous rapportons ici une méthode optimisée pour le co de la souillure des vaisseaux sanguins et fibres nerveuses selon nos protocoles précédents. Avec cette méthode, nous pouvons obtenir des images claires des vaisseaux sanguins et fibres nerveuses sans fond bruyant. En outre, nous obtenons une résolution assez élevée pour effectuer une mesure quantitative des densités avec logiciel open source. Grâce à cette nouvelle approche, nous pouvons comparer avec succès les structures et les densités des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses dans différents dépôts adipeux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Remodelage du tissu adipeux est directement liée à la dysrégulation métabolique au cours de l’obésité développement1,2. Angiogenèse et innervation sympathique sont toutes deux essentielles pour la retouche dynamique processus2,12. Développement d’une approche applicable pour visualiser les nouveaux vaisseaux sanguins, mais aussi les fibres nerveuses sont donc d’une grande importance. Métho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le National Institute of Health (NIH) subvention R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
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| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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