Совместное окрашивание кровеносных сосудов и нервных волокон в жировой ткани
Summary
Формирование новой крови судна и симпатической иннервации играть решающую роль в реконструкции жировой ткани. Однако остаются технические вопросы в визуализации и количественном измерении жировой ткани. Здесь мы представляем протокол успешно ярлык и количественно сравнить плотностью кровеносных сосудов и нервных волокон в различных жировых тканях.
Abstract
Недавние исследования выявили важную роль по ангиогенез и симпатической иннервации в жировой ткани реконструкции в ходе развития ожирения. Таким образом необходим простой и эффективный метод для документирования динамичные изменения в жировой ткани. Здесь мы описываем модифицированных immunofluorescent подход, который эффективно совместно пятна кровеносных сосудов и нервных волокон в жировых тканях. Наш подход по сравнению с традиционными и недавно разработанных методов, и относительно легко следовать и более эффективным в маркировке кровеносных сосудов и нервных волокон с более высокой плотностью и меньше фона. Кроме того более высокое разрешение изображений далее позволяет нам точно измерить площадь судов, количество ветвления, а длина волокон с открытым исходным кодом. В качестве демонстрации с помощью нашего метода мы покажем что коричневая жировая ткань (BAT) содержит большее количество кровеносных сосудов и нервных волокон, по сравнению с белой жировой ткани (Ват). Мы также найти, что среди WATs, подкожной Ват (спецназ) имеет более кровеносных сосудов и нервных волокон, по сравнению с эпидидимальных Ват (eWAT). Наш метод таким образом служат полезным инструментом для изучения ремоделирования жировой ткани.
Introduction
Жировая ткань имеет ключ, метаболические и эндокринные функции1. Она динамически расширяет или сжимает в ответ на различные питательные подчеркивает2. Активный ткани, remodeling процесс состоит из нескольких физиологические пути/шаги включая ангиогенеза, фиброза и формирование местных воспалительных микросреды2,3,4. Некоторые физические раздражители, как холодная воздействием и упражнения, могут вызвать Симпатическая активация, которая в конечном итоге приводит к образованию новой крови судна и симпатической иннервации в жировых тканях5,6. Эти процессы ремоделирования, тесно связаны с системных метаболических исходов, включая чувствительность инсулина, отличительной чертой 2 диабета типа2. Таким образом визуализация этих патологических изменений очень важно для понимания здоровое состояние всей жировой ткани.
Ангиогенез-это процесс формирования новой крови судна. Так как кровеносные сосуды обеспечивают кислорода, питательных веществ, гормонов и факторов роста тканей, ангиогенез считается ключевым шагом в жировой ткани реконструкции, которая документально с различными методами6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Однако, остаются вопросы о разрешение изображений, эффективности иммуноокрашивания и методы для количественного определения плотности судна. По сравнению с корабля Нью кроветворения, долгое время была недооценена иннервации в жировой ткани. Недавно Цзэн и др. 14 используется расширенный прижизненной микроскопии двух фотонов и продемонстрировал, что адипоцитов окружены слоя нервных волокон14. С тех пор исследователи начали ценить ключевую роль симпатической иннервации в регуляции физиологии жировой ткани. Таким образом развитие простой и практический подход к документ жировой нервной иннервации имеет важное значение.
Здесь мы приводим оптимизированный метод для совместного окрашивания кровеносных сосудов и нервных волокон, основанный на наших предыдущих протоколов. С помощью этого метода мы можем добиться четких изображений кровеносных сосудов и нервных волокон без шумной фона. Кроме того мы получаем резолюции, что является достаточно высоким для выполнения количественных измерений плотности с открытым исходным кодом. С помощью этого нового подхода, мы успешно можно сравнить структуры и плотностью кровеносных сосудов и нервных волокон в различных жировых депо.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ремоделирование жировой ткани непосредственно связан с метаболической dysregulation во время развития ожирения1,2. Ангиогенез и симпатической иннервации, так необходимых для динамических ремоделирования процесс2,12. Таким образ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (НИЗ) Грант R01DK109001 (к.с.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
