שיתוף צביעת כלי הדם, סיבי עצב ברקמת שומן
Summary
היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי לשחק תפקיד מרכזי ב שיפוץ רקמת שומן. עם זאת, נותרו בעיות טכניות ב להמחיש ומדידת באופן כמותי את רקמת שומן. כאן אנו מציגים פרוטוקול בהצלחה תווית ולהשוות באופן כמותי את הצפיפויות של כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן שונות.
Abstract
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את תפקיד קריטי של אנגיוגנזה, העצבוב סימפטית ב רקמת שומן שיפוץ במהלך הפיתוח של השמנת יתר. לפיכך, פיתוח שיטה נוחה ויעילה לתעד את השינויים הדינמיים של רקמת שומן הכרחי. כאן, אנו מתארים בגישה immunofluorescent ששונה זה ביעילות משותפת כתמי כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן. לעומת שיטות מסורתיות שפותח לאחרונה, הגישה שלנו היא יחסית קלה ויעילה יותר תיוג כלי הדם, סיבי עצב עם צפיפות גבוהה יותר ורקע פחות. יתר על כן, הרזולוציה גבוהה יותר של תמונות נוספות מאפשר לנו למדוד במדויק את האזור של ספינות, כמות הסתעפות, ואת אורך הסיבים על ידי תוכנת קוד פתוח. בתור הדגמה באמצעות השיטה שלנו, אנו מראים שאת רקמת שומן חום (בת) מכיל כמויות גבוהות יותר של כלי הדם, סיבי עצב לעומת שומן לבן (וואט). אנחנו עוד יותר מצאו כי בקרב WATs, וואט תת עורית (ימ מ) יש יותר כלי דם, סיבי עצב בהשוואה וואט epididymal (eWAT). השיטה שלנו ובכך מספק כלי שימושי עבור חוקרים רקמת שומן שיפוץ.
Introduction
רקמת שומן בעל מפתח מטבולית ופונקציות אנדוקרינית1. זה באופן דינמי מתרחבת או מתכווצת בתגובה אחרת מזין מדגיש2. הרקמה הפעילה שיפוץ תהליך מורכב מהשלבים מרובים פיזיולוגיים נתיבים/כולל אנגיוגנזה, פיברוזיס, בעיצוב של microenvironments דלקתית מקומית2,3,4. כמה לגירויים פיזיים, כגון חשיפה קר ופעילות גופנית, עלול לעורר ההפעלה סימפטי, מה שמוביל בסופו של דבר היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי רקמות adipose5,6. תהליכי שיפוץ אלה קשורות בחוזקה מערכתית תוצאות מטבולית כולל הרגישות לאינסולין, סימן ההיכר של סוג 2 סוכרת2. לפיכך, ויזואליזציה של שינויים פתולוגיים אלה חשוב מאוד להבנת מצב תקין של רקמות adipose שלם.
אנגיוגנזה הוא תהליך היווצרות כלי דם חדשים. מאז כלי הדם לספק חמצן, חומרים מזינים, הורמונים, גורמי גדילה לרקמות, אנגיוגנזה נחשב שלב מפתח רקמת שומן שיפוץ, אשר תועד עם טכניקות שונות6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. עם זאת, נותרו שאלות על הרזולוציה של תמונות, יעילות של immunostaining, ושיטות על כימות של צפיפות כלי. בהשוואה להיווצרות כלי דם חדשים, העצבוב של רקמת שומן כבר לא העריכה כראוי במשך זמן רב. לאחרונה, Zeng et al. 14 שימוש מתקדם מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital והפגינו adipocytes מוקפים על ידי שכבות של סיבי עצב14. מאז, החוקרים החלו להעריך את תפקיד מרכזי של אוהדת העצבוב בוויסות של רקמת שומן פיזיולוגיה. לפיכך, פיתוח גישה העצבוב עצב אדיפוז מסמך קל ומעשי חשוב.
כאן, אנו מדווחים על שיטה ממוטב עבור ההכתמה משותפת של כלי הדם, סיבי עצב על סמך הפרוטוקולים הקודמים שלנו. בשיטה זו, ניתן להשיג תמונות ברורות של כלי הדם, סיבי עצב ללא רקע רועש. יתר על כן, אנו משיגים רזולוציה גבוהה מספיק לביצוע מדידה כמותית של צפיפויות עם תוכנת קוד פתוח. באמצעות גישה חדשה זו, בהצלחה ונוכל להשוות את המבנים ואת צפיפות של כלי הדם, סיבי עצב ב מחסני אדיפוז שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמת שומן שיפוץ מקושר ישירות dysregulation מטבולית במהלך השמנה פיתוח1,2. אנגיוגנזה העצבוב אוהדת הן חיוניות דינמי שיפוץ תהליך2,12. לפיכך, פיתוח גישה ישימה להמחיש את כלי דם חדשים, כמו גם סיבי עצב הן חשיבות רבה. שיטות קודמות דווחו לתיעוד ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענק R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
